初级编辑:为CRISPR编辑添加精度和灵活性

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更新了2020年6月5日。

有超过75000个致病基因变异已经在人类中被鉴定出来并在ClinVar数据库。以前开发了使用核酸酶的基因组编辑方法基本编辑有可能纠正大多数细胞类型中的少数变异。一项新技术大卫刘的实验室在布罗德研究所可以增加更多的精确度和灵活性CRISPR编辑世界。

Prime编辑概述

这种新方法,发表在《自然本周早些时候,被称为prime editing。它是一种“搜索和替换”的基因组编辑技术,可以调节目标插入、删除和所有可能的碱基到碱基转换。而且,它可以组合不同类型的编辑彼此。所有这些都可以在没有双链断裂(DSBs)或供体DNA模板的情况下实现。这是如何运作的?首先,设计的工程序列编辑引导RNA(PEGRNA),其两者都指定目标站点并包含所需的编辑(S)接合原始编辑蛋白。该引物编辑器蛋白质由与逆转录酶融合的Cas9酸酶组成。Cas9蛋白质的蛋白质部分由PEGRNA引导到DNA靶位点。通过CAS9缩短后,逆转录酶结构域使用PEGRNA以期望编辑的模板逆转录转录,将DNA直接聚合到切屑靶DNA链上。编辑的DNA链取代了原始DNA链,产生含有一种含有一种编辑的链和一个未注册的股线的异络合物。最后,编辑指导异单元的解析,以帮助将编辑复制到未编辑的股线上,完成该过程。

让我们更详细地检查零件。

主要编辑:Cas9和逆转录酶的融合

为了减少初级编辑将引入细胞的成分,研究小组将M-MLV逆转录酶(RT)与Cas9 H840A nickase创建主编辑器(PE)。他们发现取向很重要:将RT融合到Cas9镍酶的c端会产生更高的编辑效率。他们称这个复合体为PE1

基于先前的逆转录酶研究,(Baranauskas等,2012年;arezi和hoogrefe,2009年), Liu实验室创建并评估了19个已知的RT突变的PE1变体,这些RT突变可以增加活性,增强模板和引物结合位点之间的结合,增加processivity,或提高热稳定性。最上面是什么?Cas9镍酶与M-MLV rt的五突变体融合,他们称之为这个系统PE2与PE1相比,在不同基因组位点的平均平均2.3至5.1倍(虽然高达45倍)的效率平均为素效率。

pegrna:一个模板和引导一体化

启动编辑的另一个重要组成部分是启动编辑引导RNA (prime editing guide RNA, pegRNA)。pegRNA是一个引导RNA,也编码RT模板,其中包括所需的编辑和同源到基因组DNA位点。序列互补的缺口基因组DNA链作为引物结合位点(PBS)。该PBS序列与靶位点杂交,作为反转录起始点。

为了优化pegRNAs,研究小组发现,将pegRNA引物结合位点扩展到至少8个核苷酸,可以在HEK293T细胞中更有效地编辑引物。

主要编辑器pegRNA复合体

用于设计PEGRNA,刘实验室创建primerdesign.是一个主要编辑设计工具,与Pinello实验室和Joung Lab。

Prime编辑器3(PE3):解决不匹配的DNA以帮助编辑

一旦Prime编辑器将编辑包含到一个股线,就在一个股线上的原始序列和另一个股线上的编辑序列之间存在不匹配。为了引导异常分辨率,有利于编辑,刘实验室转向了他们的策略以前在开发基础编辑时使用(Komor,等,2016)。通过切割未编辑的股线,它们可以使细胞使用编辑的链作为模板来重新插入该链。

名为PE3的第三个prime编辑系统通过包含一个额外的sgRNA来做到这一点。使用这种sgRNA,主编辑器将未编辑的链切离初始缺口位置(以避免产生双链断裂),在indel频率在1-10%之间的情况下,编辑效率提高了2-3倍。

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注:PE2、PE3、PE3b均使用PE2 (pCMV-PE2)。PE3和PE3b添加sgRNA, sgRNA可以是任何引导RNA表达载体或盒

初级编辑的优点

较少受PAM序列位置的限制

PRIME编辑器扩展了CRISPR Genome编辑的范围,因为它可以从PAM站点编辑近或远,使得PAM可用性如其他方法的限制。PAM-To-Edit距离可以超过30个基本对进行Prime编辑。由于DNA股线上的每〜8个碱基对发生了PAM网站,因此许多以前开发的基础编辑器(来自Rees和Liu的表1,2019)具有<8碱基对编辑窗口的基因组中Fyodor Urnov所称的“PAM沙漠”不能编辑。

比碱基编辑更灵活和精确(在某些情况下)

迄今为止开发的碱基编辑器只能创建更改的子集(C->T, G-> a, a ->G,和T->C)。基本编辑允许所有12种可能的基础到基础的变化。

Prime编辑也更加精确。例如,基本编辑器将在基本编辑窗口中编辑所有C或A,而PRIME编辑器使由PEGRNA定义的特定编辑。在旁观者编辑是不可接受的情况下,首选编辑器可用于避免这种可能性。

但是,存在传统基础编辑的实例是首选。例如,如果靶核苷酸定位在规范基础编辑窗口内,则基础编辑具有比主要编辑更高的效率和更少的凹凸。但是对于在编辑窗口内没有得到很好的位置,由于对PAM放置的依赖依赖性较低,因此优质编辑更有效。

比同源性修复更少副产品和更有效

同源性定向修复(HDR)被双链断裂刺激的刺激已被广泛用于产生精确的变化。然而Cas9的解理效率较高,而HDR的解理效率较低,这意味着大多数cas9诱导的dsb是由非同源终端连接。因此,Cas9处理导致大多数产品是indels,而HDR的效率通常低于10%。相比之下,在HEK293T细胞中,初级编辑可以提供~20-50%的效率,1-10%的indels。在其他测试的细胞类型中,包括有丝分裂后的初级小鼠皮层神经元,作者报告了较低的初级编辑效率,但仍然看到了比cas9启动的HDR更高的期望编辑插入副产物的比例。

接下来的主要剪辑是什么?

虽然Prime编辑是迈向更通用的基因组编辑的令人兴奋的步骤,但它在这一点上是新的,并保证许多额外的研究。在纸质中,刘实验室指出了以基因组的方式调查偏离目标原子编辑,识别素数编辑器可能对细胞的任何无意效果,并评估体外在活的有机体内交付策略。看到关于Prime编辑的Twitter的讨论量很令人兴奋(这里,这里, 和这里),我们也很期待接下来的精彩剪辑。

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参考

anzalone,Andrew V.等人。“搜索和替换的基因组编辑,没有双链断裂或供体DNA。”自然(2019): 1 - 1。PubMedPMID:31634902

arezi,bahram和holly hoogrefe。“莫尼鼠白血病病毒逆转录酶的新突变通过更严格的模板引物而增加热稳定性。”核酸研究37.2(2008):473-481。PubMedPMID:19056821。公共医学中心PMCID: PMC2632894

Baranauskas, Aurimas等人。新型高耐高温加工M-MuLV逆转录酶变种的产生和鉴定蛋白质工程,设计与选择25.10(2012):657-668。PubMedPMID:22691702

Komor,Alexis C.等人。“没有双链DNA裂解的基因组DNA中的目标基础的”可编程编辑。“自然533.7603(2016):420。PUBMEDPMID:27096365。公共医学中心PMCID:PMC4873371

Rees,Holly A.和David R. Liu。“基础编辑:生物细胞基因组和转录组上的精确化学。”自然评论Genetics 19.12(2018):770-788。PubMedPMID:30323312。公共医学中心PMCID:PMC6535181

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