用CRISPR/Cas9标记蛋白质:与Mendenhall和Myers的对话

由肯德尔摩根

埃里克·m·林业局阿拉巴马大学亨茨维尔分校的埃里克·门登霍尔(Eric Mendenhall)解释说,他实验室的主要目标是了解基因组非编码部分的功能。门登霍尔和哈德逊阿尔法学院的理查德·迈尔斯(门登霍尔也是哈德逊阿尔法学院的兼职教员)作为哈佛大学的一员,多年来一直致力于这个目标DNA元件百科全书计划ENCODE是美国国立卫生研究院资助的一项研究,旨在确定人类基因组的所有功能元素。

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这对研究人员从一种被称为ChIP-seq的成熟方法开始,将相当多的注意力集中在转录因子上。ChIP-seq依赖于抗体来直接识别和结合转录因子,但这是一个缓慢的过程,在很多情况下都不起作用。为了追踪到每一个基因调控蛋白以及基因组中可以更快更有效地找到它们的位置,它们最近适应了CRISPR / Cas9蛋白质标记系统。

我们与Mendenhall和Myers谈论了他们新的CRISPR标记系统,这是他们现在在Addgene提供的。有关目前可用的质粒和详细协议的更多细节,请访问www.addgene.org/crispr/tagging

Addgene:是什么促使你将CRISPR应用于蛋白质标记?

迈尔斯:我们的实验室在几个项目上紧密合作,这是一个与基因表达有关的项目。ENCODE项目的一个目标是观察所有1500或1600个转录因子,并找出它们与基因组结合的位置。我们已经用这个叫做ChIP-seq的实验做了好几年了,但是对于很多转录因子来说真的很难。我们的团队一起将CRISPR用于标记实验,它看起来已经产生了很大的影响。我们现在可以研究更多的转录因子。

Addgene:这个系统是如何工作的?

林业局:该系统确实非常简单,但它提供了提高效率和吞吐量。在改造CRISPR/Cas系统时,我们所做的是加入第二个质粒,将表位标签靶向到转录因子上。顺便说一下,你可以用它在各种不同的检测中标记任何蛋白质,不仅仅是转录因子。

第二载体是具有同源臂的同源定向修复供体质粒和一个选择标记。如果工作正常,第二个质粒会在转录因子的末端插入一个叫做FLAG的小表位标签。它也给了细胞对新霉素的抗生素耐药性,这样你就可以选择带有标记转录因子的细胞群。

FLAG抗体已经被很好地描述了,该系统允许你将相同的抗体添加到任何蛋白质,以获得真正美丽的ChIP-Seq结果。FLAG表位非常小——20个氨基酸——所以我们认为它不会干扰蛋白质的功能。

迈尔斯:我们已经将我们的新系统与已知具有良好抗体的转录因子的标准ChIP-seq进行了比较。结果看起来几乎一样。

Addgene:您的系统在这种情况下有什么优势?

林业局:CRISPR/Cas9的优点是双重的:CRISPR/Cas9具有诱导双链断裂的高效率和更多的机会同源重组。在CRISPR出现之前,这种重组是百万分之一的事件。现在可能是1 / 100或50。第二个质粒的克隆可以在一天内完成一次组装反应。这第二个质粒为你节省了几周的时间。CRISPR为你节省了几个月的时间。它具有更高的吞吐量和更快的速度。并行运行也很容易。

Addgene:除了快速和高效,这个系统还帮助解决了哪些其他挑战?

迈尔斯:细胞内只有一小部分蛋白质有针对它们的商业抗体。还有一个问题是这些相互作用有多具体。这种CRISPR系统用一种通用抗体解决了这一问题。这是人类或其他细胞中没有的抗原决定位。它是人工制造的。也就是说你没有任何背景信息,也没有交叉反应。我们已经为转录因子开发了这个,但是有很多原因你可能想要一个这样的系统。让我们惊讶的是,世界上竟然没有一百种不同的版本。

Addgene:为什么让其他科学家快速获得这些质粒对你来说很重要?

迈尔斯:我们希望能弄清楚如何对成百上千的转录因子做到这一点。我们想要一些能够实现自动化的东西。这种设计减少了几周的等待和手工劳动。这是一件大事。有了Addgene,现在任何人都可以以适中的成本获得这些,而不必从头开始或写信给我们来获得它们。尽管我们很乐意提供这些服务,但这永远不会大规模奏效。世界现在太大了。

林业局:很多研究小组一直在与这种抗体问题作斗争。我们认为把这些东西放出去是正确的。这是一个简单的解决方案。如果不尽快分享,那就太愚蠢了。

Addgene:你对这个新工具感兴趣吗?

林业局:自从3月份在冷泉港的ENCODE协会提出这个问题以来,我们已经收到了很多请求。许多小组都很兴奋,并向他们提出了方案。自从Addgene页面上个月上线以来,已有超过340人注册接收质粒可用时的警报。

我们也有一些要求对我们开发的质粒进行变异。我们正在努力,但这个系统太灵活了。其他研究人员可以很容易地使这些载体与他们喜欢的选择盒式磁带一起使用。他们也可以从FLAG切换到绿色荧光蛋白或者是不同的抗原表位。

Addgene:对于那些想要在自己的工作中应用这个标签系统的人,您有任何额外的提示、技巧或忠告吗?

林业局:我们已经准备好了协议在这里。我们经历了一些坎坷,我们希望其他团队能够避免这种情况。我们发现的一件事是,它是非常顺利的秩序的同源臂作为一个gBlocks®基因片段DNA技术集成。一般来说,任何在实验室使用CRISPR/Cas9的人都应该能够运行这个协议。

我们也想给其他可能做类似事情的实验室施加一些社会压力。可能还有其他的变量对某些实验来说比我们现在做的更好。我们鼓励那些已经开发了自己的系统或使用和调整我们的试剂的人考虑将他们添加到Addgene的特殊收集CRISPR标签系统


感谢门登霍尔教授和迈尔斯教授的演讲!

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