劳力病毒所有东西的快速指南

由Benoit Giquel.

如果您有兴趣使用慢病毒载体伟德BV下载要将您最喜欢的基因介绍进入您最喜欢的细胞系或进入主要单元格,这篇博客文章将为您提供一些提示,以使用慢动动力矢量系统计划实验。

伟德BV下载自90年代初期在90年代初前使用以来,病毒载体在基本和应用的研究中越来越受欢迎。在使用的不同载体中,慢病毒载体构建体已被证明是非常有用的,因为它们感染划分和非分裂细胞,包括干细胞。这些属性使致使致命的传染媒介提供奇妙的交付选择伟德BV下载Shrna.CRISPR / CAS9.组件,且荧光传感器

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逆转录病毒矢量背景

直到病毒载体的发展,基因转移到哺乳动物细胞中经常依伟德BV下载赖于化学物质(CaCl2,阳离子脂质体)或电气(电流形成膜孔)转染。这些技术仍然有效地使用和有效地转移质粒DNA,以将永生化的细胞系分成,但是当涉及将DNA转移到原代细胞或非分割细胞中时达到它们的极限。为了靶向这些未转染细胞,实验室使用病毒载体,特别是逆转录病毒载体,因为它们靶向更广泛的细胞,它们在伟德BV下载基因组中的整合更有效。

使用的第一个逆转录病毒载体源自伟德BV下载Moloney鼠白血病病毒(MOMLV),并由两种质粒组成:包装质粒含有生产病毒颗粒(GAG,POL,TAT,REV和EV)和编码感兴趣插入的转移质粒以及将其插入到病毒颗粒中所需的序列所需的所有结构基因(包装信号psi)。因为包装质粒缺乏PSI信号,所以编码结构蛋白的基​​因不能整合到新的病毒颗粒中,并且产生的病毒颗粒无法复制。然而,母亲自然发现一种重新创造功能病毒的方法。实际上,通过测试几个载体和包装细胞系组合,Miller等人。表明,在通过将逆转录病毒转移到包装细胞系PA12(含有PSI缺失)产生的高滴度逆转录血液中产生传染性野生型病毒。载体质粒和包装质粒之间的双交叉事件导致PSI序列置于形成可以产生复制态病毒的载体的包装质粒上。尽管该系统在将目的基因转移到适当的细胞时是有效的,但显然其安全性是缺点,特别是对于临床发展。此外,MOMLV在感染非分裂细胞时效率低,因此研究人员旨在创造更好,更安全的系统。

与Momlv,Lentiviruses不同,单独的属retroviridae.包括人类免疫缺陷病毒型-1(HIV-1)的家庭可以感染分裂和非分裂细胞。T.他感染非分裂细胞的能力不限于体外细胞培养作为慢病毒衍生的载体能够转化某些静脉或终端分化的细胞,例如巨噬细胞和微胶质细胞。这家属性使Lentivirus成为基因转移载体的有吸引力的选择。

慢病毒载体伟德BV下载

虽然逆转录病毒仍在使用中,由于其感染非分配细胞的能力,已经致力于开发有效和安全的HIV-1衍生的慢病毒载体。伟德BV下载因此,到目前为止已经建立了三种不同的慢病毒载体,每代安全增加。伟德BV下载

  • 第一代of lentiviral vectors consisted of three plasmids encoding 1) the lentiviral vector genome which was composed of the wild-type 5’ and 3’ LTRs, the ψ sequence, a part of the env gene containing the rev response element (RRE), an internal promoter, and the desired gene (transfer vector plasmid), 2) the HIV-1 genome containing all viral genes with the exception of the env gene (packaging plasmid), and 3) the vesicular stomatitis virus G protein (VSV-G) that improves the stability and broadens the cellular tropism of the viral particles produced. However, in this vector production system, there is still a potential risk for the generation of replication competent lentiviruses (RCL) especially if you are working on HIV positive human cell from the clinic.
  • 第二代类似于第一个,除了未除去对生产慢病毒颗粒的生产不是必需的HIV辅助蛋白。这一代比第一个更安全,并且可以在研究实验室定期使用。产生RCL的风险很低,但必须特别注意额外的护理,特别是如果您使用原型癌症或尚未测试艾滋病毒的人类样品。如果不使用适当的技术,总是有一小机会,研究人员可以用致癌病毒感染他或自己,或者艾滋病毒阳性细胞中的辅助因素可以使病毒复制能力。
第二代慢病毒包装系统
  • 第三代慢病毒包装系统第三代在临床环境中为安伟德BV下载全使用而开发了慢病毒载体。In this generation, the HIV Tat gene (previously used to drive expression from the LTRs) has been removed, Rev (which facilitates nuclear export) is expressed from a separate plasmid, and the promoter of the 5’LTR has been deleted to reduce its activity. A CMV or an EF1α promoter has been inserted in this LTR so you don’t need Tat to transcribe the viral genome in producing cells. Currently, the third-generation lentiviral vector system offers the best safety profile in terms of RCL generation because this vector requires only three HIV-1 genes (gag, pol, and rev) for production. Third generation lentiviral vectors can be used for research and for clinical purposes, however improving the safety of these vectors is still an active area of research due to the possibility that mutation or recombination with human retroviruses could lead to RCL.

关于转导功效,已经显示了第2和第3代的第3族之间的差异。但是,在第3代中,您可以获得较低的病毒滴度而不是第二代。了解这一点,您可以扩展生产设置并净化并浓缩您的慢病毒颗粒,以使其成为感染感兴趣的细胞的最佳集中度。

好处 缺点
可以携带大转基因(> 8 kB) 产生复制竞争力的慢病毒(RCL)的潜力
高效基因转移 插入诱变的可能性:具有人类对抗的复制 - 无能的慢病毒仍然可以感染研究人员并插入她/他的基因组 - 这是一种生物安全风险
感染分裂和非分裂细胞
没有产生免疫原性蛋白质
稳定的整合到宿主基因组和转基因稳定表达中

转移质粒

转移质粒是你克隆你感兴趣的基因的矢量,是你的实验的重要特征;它必须仔细选择。研究人员常常想要一个简单的设置,其中感兴趣的基因与标记一起表达(荧光蛋白或者选择标记)允许选择转导细胞。在这种情况下,您的基因和标记物可以通过内部核糖体入口部位分离(爱好者)并在同一个启动子下表达。或者,您的基因和标记物可以在两个不同的启动子的控制下置于两种不同的启动子下。单一和双启动子转移载体都可以用于表达兴趣的基因,无论是组成的还是诱导的。如果您感兴趣的基因是有毒的,或者需要在细胞周期中表达某个点,则应使用具有诱导型启动子的转移载体(见下文)。

诱导的慢病毒转移载体

最广泛使用的诱导型慢病毒载体系统是四环素(TET) - 调节系统。您可以选择TET关闭系统或TET ON系统。在TET OFF系统中,TET响应元件(TRE)被放置在转移载体中的启动子的上游。在没有四环素或衍生物的衍生物如十二胞环素(DOX),TET控制的异椎灭菌剂(TTA也表达)与TRE结合并激活基因的表达。然后在文化中添加DOX将压制您的目标基因。该系统是有效的,但您必须意识到存在通常的背景活动,并且需要连续地管理DOX以压制转基因表达。相比之下,在TET上的系统中,TTA已被修改(并重命名RTTA),仅在DOX存在下绑定TRE。在这种情况下,您的基因以稳定状态抑制,并且当DOX添加到培养物中时表示。与TET-OFF系统相比,该系统现在显示出快速基因表达动力学。TET系统的一个缺点是它通常需要将两个不同的表达载体输送到靶细胞 - 一种含有感兴趣基因的细胞(PTET-IRES-EGFPPPRIME-TET-GFP-FF3.)和TTA或RTTA(fuw-m2rtta.)。在这种方法中,细胞群体可以仅表达TTA或转基因,导致令人遗憾的令人遗憾,并且可能使其难以解释您的结果。这可能是您实验的瓶颈。包含转基因和TTA / RTTA(Pinducer20.Pinducer21.)已经开发出来,但这些载体非常大,当使用它们时,您可能会降低病毒滴度。

关于生物安全性,意识到慢病毒颗粒是一种强大的方式来诱发细胞 - 即使是你自己!因此,您应该谨慎地将可能有害的基因插入转移载体中。表达致表达原癌基因或癌基因的慢病毒颗粒应该用护理进行操纵。看看NIH的生物安全指南有关更多信息,请务必在开始任何工作之前务必咨询您的机构生物安全委员会。

慢病毒生产和转移

一旦你克隆到慢病毒转移载体中感兴趣的基因,下一步就是产生病毒颗粒。为此,您将首先需要用转移质粒和包装质粒转染生产细胞,通常是293T细胞。为此,您可以使用您对最舒适的转染试剂。如果您没有任何转染经验,CACL.2转染是一种简单廉价的技术,应该很好。

转染后快速(4-8小时),细胞开始将病毒颗粒释放到培养上清液中,并且通常可以在转染后24h收获含上清液的病毒。该上清液可以储存在4°C或可以直接添加到目标单元格中​​。但是,在这种情况下,您不知道您在文化中有多少病毒粒子。由于病毒生产可以从一批到另一批次变化。对于实验一致性,纯化和滴定病毒是一个好主意。病毒纯化可能是一个棘手的过程。您必须离心培养上清液以沉淀病毒颗粒。一些方案建议将蔗糖添加到上清液中以产生良好的密度的梯度,这些密度是有利于病毒沉淀的。我的提示对于此过程是测试已描述的几种协议(协议1协议2.协议3.)找到将为您的系统提供最佳生产的人。

查看我们的协议页面以满足慢病毒生产转导方案

一旦净化,你必须滴答你的病毒粒子确定它们的浓度。广泛用于病毒滴定的三种方法:P24 ELISA给药方法检测病毒衣壳抗原P24的表达,FACS给药方法将病毒滴度与由GFP编码病毒转导的细胞数量相关联,并且逆转录酶活性测定使用QPCR量化病毒RNA。所有这些方法都已在以前描述伟德体育中心

一旦您了解您的病毒滴度,您可以在不同多种感染的病毒中孵育您的细胞(MOI =病毒与细胞的比率)。同样,我的提示是测试几个协议,因为设置取决于您想要感染的单元格类型。您将发现的大多数协议都将建议使用涤纶(如Colybrene)(协议)或deae dextran(协议),帮助病毒颗粒与您的靶细胞结合。如果您正在转化非粘附细胞,则可能需要将细胞与病毒离心,以便辅助病毒结合。这种方法称为Spingoculation,已被发现非常有效T细胞转导例如。

我希望您能找到此信息对您的实验有用。不要犹豫检查我们的慢动动力矢量指南获取更多信息并获得访问其他协议和质粒。


参考

1。Miller,A. Dusty和C. A. R. O. L. Buttimore。“重新设计逆转录病毒包装细胞系,以避免重组导致辅助病毒的生产。”分子和细胞生物学6.8(1986):2895-2902。PubMed P.中期:3785217。pmed中央PMCID:PMC367857

纳尔德尼,路易吉等。“在慢病毒载体中,在体内基因递送和稳定转导的不定流细胞。”科学272.5259(1996):263PMID:8602510.

3。Yasutsugu Suzuki和Youichi Suzuki(2011年)。基因调节慢病毒载体系统,病毒基因治疗,柯旭博士(ed。),ISBN:978-953-307-539-6,Intech。

4。Walter,W.和U. Stein。“伟德BV下载基因的病毒载体转移对人类疾病治疗的审查。”毒品60(2000):249-71。PubMed.PMID:10983732

5。基因治疗网慢病毒载体页面伟德BV下载

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