没有套件的RNA提取

由Leah Schwiesow.

与DNA隔离一样,科学家通常依赖RNA隔离套件,使其生活更容易。最近,我们发表了一个博客DNA纯化没有套件这概述了几种原因,为什么没有套件的事情有优势:较少的塑料浪费,少消费,并且当所有旋转柱用完时,剩下一堆随机解决方案。在本文中,我们涵盖了没有试剂盒的分离RNA的基础知识。

使用RNA的提示(无论您是否使用套件或不使用套件)

尽管不用说,在进行任何类型的DNA或RNA纯化时都应该小心,以避免污染,但在进行RNA提取时要格外小心。RNA天生就不像DNA那样稳定——它是单链的,其核糖基团容易水解和热降解。此外,RNA酶,或降解RNA的酶,是一种特别耐劳的蛋白质,存在于包括皮肤在内的所有物质中。以下是一些使用RNA的一般技巧,即使你使用的是工具包:

  • 一定要戴上手套,因为你手上的RNA酶可以降解RNA。
  • 保持工作区域的清洁,这可能包括在你的工作台上喷洒去除RNaseZAP等rnase的产品。
  • 在收获组织,细胞,植物,真菌或细菌时,使样品冷却并迅速工作以减轻RNA降解。
  • 确保使用DEPC处理或RNase自由水。如果使用DEPC处理的水,高压灭菌水以灭活DEPC。
  • 确保使用的塑料软件或玻璃器皿是免费的。无需从科学供应商和玻璃器皿中获得RNASE的塑料,应使用DEPC溶液处理1小时,并高压灭菌以除去残留的DEPC。或者,可以在180℃下烘烤玻璃器皿至少4小时。
  • 如果您的最终RNA样品重新悬浮在水或TE缓冲液中,请将它们储存在-80°C冷冻机中以防止RNA降解。它们会在-20°C冰箱中降解。

RNA提取方法演变为今天仍然使用的简单协议

有许多不需要试剂盒就可以分离DNA的替代方法。然而,RNA的提取和纯化却不是这样。有一个简单的可行方法,以及该方法的变体。开发分离RNA方案的一个主要障碍是,RNase通常在细胞中发现,如果没有什么东西来阻止RNase在细胞裂解时的活性,RNA就会降解。为了有效地分离完整的RNA,需要一种快速、强的蛋白质变性剂——在RNA酶在细胞裂解时有机会分解RNA之前,这种变性剂就能分解RNA。

20世纪70年代末,Chirgwin和他的同事们发现了一种强大的蛋白质变性剂,硫氰酸胍,做到了这一点(Chirgwin等,1979)。他们开发了一种协议,用于将其与大鼠脾脏中的RNA分离,其中在硫氰酸胍溶液中均匀化脾脏并旋转匀浆以除去不溶物。然后,将匀浆加载到氯化铯梯度上并超速离心至多20小时以将完整的RNA与DNA和蛋白分离。虽然在隔离总RNA时非常有效,但这种方法需要大量的时间,并且取决于您可能有多少样品,可以访问一个或多个大,昂贵的超速纤维。

没有试剂盒的RNA提取的步骤包括均质化和裂解,相分离,提取和沉淀,并重悬浮
图1:RNA提取中不同步骤的轮廓。

NIH的研究人员在1980年年中,开发了一种完全跳过超速离心的协议。Chomczynski和Sacchi表明RNA可以通过A通过DNA和蛋白质有效地分离出来用硫氰酸胍 - 苯酚 - 氯仿的简单提取方案.在该方法中,样品仍然均质化并在硫氰酸胍溶液中裂解。然而,使用氯化铯梯度,水饱和酚,乙酸钠和氯仿的RNA分离加入到匀浆中,并摇动。在快速离心(不超速离心!)后,将苯酚和氯仿分开的层分开,并且RNA保留在顶部,水层中,而DNA和其他蛋白质被保留在邻间和底部的有机层中。提取顶部水层,然后可以沉淀RNA。该方法减少了将RNA从20多小时分离为4小时到4小时的时间,并且目前仍然广泛使用了该无套件方法的变化(Chomcynski和Sacchi,2006)。

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制作简单的协议更加简单(仍然没有套件!)

如上所述,使用RNA需要保持样本低温直到均质和细胞裂解。这取决于你的实验室情况或组织收集方法,因此生物技术公司已经推出了一些产品,有助于进一步简化这一过程和/或在组织收集和均质过程中稳定RNA。这些产品中最广为人知的是TRIzol®(也称为TRI Reagent®,RNAzol®,QIAzol®,由许多不同的公司销售)。TRIzol®是一种一体化的酸-胍-苯酚溶液,将原无试剂盒协议的均质化溶液和苯酚添加到一个步骤中。在TRIzol®中均质后,离心去除不溶物,上清液用氯仿提取,如上述无试剂盒方法。

研究人员还开发了在细胞裂解之前“稳定”组织内的RNA的方法。这些产品,即来自QIAGEN的Thermo和RnaProtect®的Rnalater®是基于硫酸铵的解决方案在细胞或组织中抑制RNase活性- 它们实际上并没有化学稳定RNA分子(Allewell和Sarma,1974)。此外,Thermofisher提供了一个有关如何使用TrizoL®的RNALATER®集成的协议硫酸铵稳定溶液可以在房屋中制造

无试剂盒RNA提取方法的一个常见问题是DNA的携带,这可能会使下游应用的结果复杂化,如定量PCR来评估基因表达。研究人员可以做几件事来解决这个问题。首先,注意你的提取——如果你需要真正干净的RNA,重要的是要确保提取时,只取水层,以避免从底层有机层携带DNA。另一个技巧是使用氯化锂沉淀RNA.LiCl溶液选择性地沉淀RNA,但不是DNA和蛋白质。最后,使用DNase(市场上有几种DNase酶产品可供选择),在重新悬浮的RNA样本上有助于确保DNA污染不是一个问题。

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参考

Allewell NM,SAMA A(1974)硫酸铵对核糖核酸酶A的活性的影响A. Biochimica等生物物质Acta(BBA) - 酶学341:484-488。https://doi.org/10.1016/0005 - 2744 (74) 90240 - x

Chirgwin JM, Przybyla AE, MacDonald RJ, Rutter WJ(1979)从富含核糖核酸酶的来源中分离具有生物活性的核糖核酸。生物化学18:5294 - 5299。https://doi.org/10.1021/BI00591A005

Chomczynski P, Sacchi N(1987)单步法分离RNA的酸硫氰酸胍-酚-氯仿萃取。分析生物化学162:156 - 159。https://doi.org/10.1016/0003 - 2697 (87) 90021 - 2

Chomczynski P, Sacchi N(2006)采用硫氰酸盐-酚-氯仿萃取的单步RNA分离方法:20多年前。自然协议1:581 - 585。https://doi.org/10.1038/nprot.2006.83

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