植物生物学中的RNA干扰:旧的最爱的新工具

客人的博客

这篇文章由最近收到P的Robert Orr提供奖项伍斯特理工学院生物与生物技术博士学位。

RNAi是什么?

职能丧失(LOF)实验担任我们对复杂生物过程的理解的构建块。在DNA,RNA或蛋白质水平的直接或无偏见的方式中存在许多工具。在生物问题的背景下,“正确”工具选择需要仔细平衡任何技术的任何技术的局限性。例如,虽然基因敲除长期被认为是LOF研究的“金标准”,但在植物中发现的高基因拷贝数来自实际角度的传统淘汰。因此,在DNA下游的技术,例如RNA干扰,可以无关地施加与基因拷贝数无关的效果。

RNA干扰(RNAi)是一种保守的真核生物过程,其中双链RNA(DSRNA)的大约20-30个核苷酸导致含有与DSRNA互补的序列(Wilson和Doudna,2013)的序列的任何基因的下调或“沉默”.

RNAi由两种非专属的基因沉默途径组成:转录和转录后基因沉默(PTGS)。在这两种途径,短双链RNA片段(siRNAs)是由长dsRNA通过一个名为小礼帽的核糖核酸酶III酶(图1)。植物王国已经扩大了的帽子不同Dicer-like酶和酶是参与生物起源不同的小分子RNA(图1)。这些siRNAs可以发挥他们的基因沉默效应靶向mRNA降解、阻断翻译或染色质修饰互补基因序列(图1)。因此,外源应用长或短dsRNA很容易导致基因沉默。然而,需要注意的是,裸的和未修饰的双链rna会引起免疫原性反应,使RNAi的有效性和解释复杂化。幸运的是,研究缺乏这种先天免疫的植物和其他生物体的研究人员不必担心,他们已经从dsRNA应用的方便性中受益。

RNA-I-原理图
图1:RNAi诱导转基因的示意图。通常,RNAi的所需靶表示为倒置重复,其通过促进形成发夹RNA结构的环形区域,导致内源性RNAi机械加工。或者,可以设计内源性miRNA前体以产生人造miRNA。然后将加工的miRNA或siRNA沉默于转录或后转录的靶基因。在植物中,不同的Dicer样酶(DCL)将DSRNA加工成特定类型的干扰RNA。

RNAi vs. CRISPR:互补技术

可以说,CRISPR彻底改变了分子生物学,并以前所未有的方式使功能研究成为可能。随着CRISPR技术的迅速崛起和多样性,人们可能会错误地将RNAi归入历史。RNAi的直接性是无与伦比的——与需要外源蛋白的CRISPR实验不同,成功的RNAi诱导只需要dsRNA的存在。在植物中,CRISPR技术主要用于破坏DNA水平的功能,从而限制了CRISPR在高拷贝数和低可及性基因组位点上的有效性。此外,基因敲除策略不能用于研究必需基因。

历史上,基因沉默方法被认为是普遍的脱靶效应。这一结论是基于大量表型差异之间的基因沉默和敲除方法相同的基因。然而,最近的研究对这种普遍的假设提出了质疑。具体而言,由于使用外显子跳过、替代起始密码子和/或转录适应现象,被认为是敲除的crispr生成的突变体可以维持部分功能(Smits et al., 2019;Sztal和Stainier, 2020年)。此外,一项研究在高通量生存筛选的背景下直接比较了CRISPR和RNAi,发现两种技术的精确性相同,但每种方法恢复的是已知的生存能力所需的不同基因(Morgens et al., 2016)。只有将两种方法生成的数据结合起来,才能形成更全面的基因列表,准确地反映出已知的对细胞生长至关重要的基因范围。总之,这项出色的工作强调了使用正交方法来确定感兴趣基因的功能的重要性。

RNAi的工具

可以说,RNAi最大的优势是技术的直接性——所有这些都需要与你的基因或感兴趣的基因互补的dsRNA来触发RNAi激活。

一个典型的RNAi实验可以分为三个基本步骤:

  • RNAi触发器的创建
  • 传递RNAi触发器
  • 表征RNAi表型。

虽然所有这些步骤都是积极发展的领域,但第一步必然决定其后两步的方向和范围。因此,我将重点介绍rnai研究第一阶段的不同方法和考虑。

RNAi触发器的创建需要一些初步考虑因素,例如在激活RNAi机械(长DSRNA,通常发夹RNA或人造MICRRNA)时DSRNA的起始材料(基于DNA的载体或纯化的RNA)和初始状态。使用DNA模板来触发RNAi是最普遍的方法,因为它易于使用并且能够产生长期的RNAi表型。

长发夹RNA

诱导RNAi最简单的方法是表达长发夹RNA (hpRNA)。这种方法是便利的DNA构建,使插入~ 400bp互补的基因目标作为反向重复(图1)利用这种技术,如果a采用一致性序列(目标间的一致性~90%)或多个目标序列串联.hpRNA在植物研究中得到了广泛的应用,在植物群落中有许多不同的结构。每个结构都有独特的特征,例如hpRNA的可诱导表达和/或将基因靶序列融合到荧光报告序列(下面讨论)。这些构造的示例包括pGAPi,这使得通过基于网关的克隆和接受RNAi的植物的直接阳性选择,可以轻松创建长hpRNALIIbeta F - 1-2 RNAi,这使得内含子剪接的hpRNAs可以通过金门克隆进行组装。

人造微RNA和短发夹RNA

长期曲线方法的最大局限被认为是脱靶效应和可变的沉默效率。为了解决这些缺点,经常使用短的HPRNA(SHRNA)和人造微RNA(AMIRNA)。虽然类似,Amirnas从基因组中发现的微小Randas的内源性前体设计,而ShRNA被外源衍生。重要的是,代替从长HPRNA触发产生的分类SIRNA,使用SHRNA / AmiRNA产生单〜21-NT干扰RNA。尽管sh-和amiRNAs可能比长hpRNAs更特异,但它们必须经过单独的工程设计和经验评估其基因沉默效果,因此需要大量的时间投资。

一旦靶mRNA切割,切割的mRNA就可以诱导进一步的RNAi。该过程称为“传递性”,调用关于给定RNAi技术的特异性的任何权利要求。虽然转运增强了RNAi的效力,但也可以增加偏离目标效果的发生。然而,基于Amirna的RNAi实验常规地显示高度特异性和鲁棒的基因沉默(在amirna的初始优化之后)。虽然需要下游工作,但是在addgene可以找到几个载体,可以作为优异的开始(#22988,#137884)。两种载体分别允许基于水稻和拟南芥物种的miRNA前体创建Amirnas。

短发夹RNA (Short hairpin RNA, shRNA)在概念上与上面提到的microRNA前体相似,是哺乳动物研究领域中一个流行的RNAi触发器。幸运的是,许多哺乳动物shrna的工具可在addgene提供。

识别主动沉默植物

一旦你将RNAi引入你的生物体,你如何识别主动沉默的那些?在这里,我将介绍一些识别它们的筛选方法。

视觉检查

无论你决定何种RNAi触发类型,任何RNAi实验都可以从一种简单的方法中获益,这种方法可以识别和量化主动沉默的植物。非破坏性方法,最常见的荧光报告者,直接耦合沉默你的基因目标沉默报告者这是在DNA构建体的水平上实现的,其中您的RNAi靶融合到含有倒置荧光报道的靶序列的DNA骨架中的倒置重复取向。因此,生产单一发夹蛋白质DSRNA,其含有对您感兴趣的基因和记者的序列。这种方法大大提高了实验过程,因为可以容易地鉴定沉默植物并且具有量化的可观察表型。基于荧光报道的RNAi结构已经在植物中设计和广泛实施,例如在模型开花植物中拟南芥(Li et al., 2013;Zhang et al., 2018)和模型苔藓植物PhyscomitriumPhyscomitrella金属盘(Bezanilla等人,2005;Nakaoka等人,2012)。

一种新的基于正选择的RNAi方法

到目前为止,所有基于dna的RNAi实验通常都是通过选择抗生素来检测RNAi转基因基因的存在,然后通过荧光读出RNAi活性。作为一名植物研究者,传统的hpRNA和视觉筛选方法在分离RNAi植物时受到两方面的限制:可变沉默效率和劳动密集型过程。通过RNAi的可视化报告,表型,如形态参数,可以很容易地进行评分。然而,确定你的特定目标的转录本或蛋白质丰度需要对视觉识别的亚群进行物理隔离。对于传统的细胞培养,通过荧光激活细胞分选(FACS)可以很容易地丰富你的活性RNAi亚群。这在植物中是不可能的,除了有限的,单细胞原生质体分析。相反,显微镜下的植物必须通过荧光报告物进行RNAi目视识别,并手工提取。这一过程是冗长而耗时的,因为生长表型减少的RNAi突变体需要额外的植物来有足够的组织来进行下游特性表征。

为了同时解决传统RNAi方法的局限性,我和其他人在Luis Vidali Lab.设计了一种新的RNAi方法。我们没有使用荧光输出来监测RNAi,而是设计了一种阳性选择报告基因,生存本身就表明了活性基因沉默。我们通过创建直接融合任何基因靶向序列到腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APT)基因的靶向序列的结构来实现这一目标,这在许多生物体中是保守的。当补充腺嘌呤类似物如2-氟腺嘌呤(2-FA)时,具有功能APT的生物体将2-FA转化为细胞毒性核苷酸,从而导致死亡。在2-FA存在的情况下,APT的有效基因沉默是生存所必需的。通过将APT沉默与任何感兴趣的基因靶标偶联,只有活跃沉默到足够程度的生物才能存活。这可能减少了RNAi输出的可变性,并简化了下游特性,因为整个培养物可以收获,而不是微观分离。进行基于apt的RNAi实验所需的质粒是现在在addgene上提供.这些包括结构,允许容易插入任何目标序列,以及必要的控制质粒。

从Luis Vidali的实验室找到RNAi质粒!


非常感谢我们的客座博主Robert Orr!

Robert-Orr-headshot-min罗伯特·奥尔(Robert Orr)最近在伍斯特理工学院(Worcester Polytechnic Institute)获得了生物学和生物技术博士学位,他在路易斯·维达利(Luis Vidali)的实验室研究了植物如何实现极化细胞生长。为了他的下一个冒险,他将加入苏黎世大学达伦·吉尔摩的实验室。他对生物是如何在细胞和多细胞尺度上精巧而有力地自我组织而着迷。

参考文献

Bezanilla M, Perroud P‐F。那Pan A, Klueh P, Quatrano RS (2005) An RNAi System in Physcomitrella patens with an Internal Marker for Silencing Allows for Rapid Identification of Loss of Function Phenotypes. Plant Biology 7:251–257 .https://doi.org/10.1055/s-2005-837597

Li J- f, Chung HS, Niu Y, Bush J, McCormack M, Sheen J (2013) Comprehensive protein based Artificial MicroRNA screening for Effective Gene Silencing in Plants.中国生物医学工程学报。植物细胞25:1507-1522。https://doi.org/10.1105/tpc.113.112235

Morgens DW, Deans RM, Li A, Bassik MC(2016)系统比较CRISPR/Cas9和RNAi筛选关键基因。Nat Biotechnol 34:634-636。https://doi.org/10.1038/nbt.3567

Nakaoka Y,Miki T,Fujioka R,Uehara R,Tomioka A,Obuse C,Kubo M,Hiwatashi Y,Goshima G(2012)Physcomitrella Patens的诱导型RNA干扰系统揭示了Augmin在Phragmoplast Microotubule发电中的主导作用。植物细胞24:1478-1493。https://doi.org/10.1105/tpc.112.098509

Smits AH, Ziebell F, Joberty G, Zinn N, Mueller WF, Clauder-Münster S, Eberhard D, Fälth Savitski M, Grandi P, Jakob P, Michon A-M, Sun H, Tessmer K, Bürckstümmer T, Bantscheff M, Steinmetz LM, Drewes G, Huber W(2019)生物可塑性拯救了CRISPR敲除中的靶活性。Nat方法16:1087-1093。https://doi.org/10.1038/s41592-019-0614-5

Sztal TE, Stainier DYR(2020)转录适应:一种潜在的基因稳健性机制。开发147:dev186452。https://doi.org/10.1242/dev.186452

Wilson RC,Doudna Ja(2013)RNA干扰的分子机制。annu Rev Biophys 42:217-239。https://doi.org/10.1146/annurev-biophys-083012-130404

张宁,张东,陈双林,龚伯强,郭勇,徐玲,张学宁,李建峰(2018)工程人工microrna的多基因沉默和简化转基因筛选。植物生理学杂志https://doi.org/10.1104/pp.18.00828

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