Rosella:用于研究自噬的荧光ph -生物传感器

由贝丝学会主席

罗塞拉是一个pH-sensitive荧光生物传感器和Addgene一起储存的马克·普雷斯科特博士。该系统用于监测和分析酵母细胞的细胞质和细胞器的自噬。自噬(希腊语为“自我进食”)是由于缺乏营养而引起的,以细胞质和细胞器为目标的液泡/溶酶体降解和再循环。罗塞拉自噬感知能力的关键在于,当它从一个更中性的pH区(如胞浆)到高pH的液泡时,它的荧光发射光谱发生变化。继续读下去,了解更多以前研究自噬的方法,以及罗塞拉是如何改进它们的。

下载荧光蛋白101电子书伟德2021足球欧洲杯买球平台

研究自噬的方法

生化检测

  • 长寿蛋白降解:该方法测量放射性标记的长寿命蛋白的降解率,作为自噬的代理。细胞用同位素标记的氨基酸培养数小时到数天,然后用未标记的氨基酸进行短时间的生长。这个洗脱期主要通过蛋白酶体降解去除放射性标记的短命蛋白。然后通过测量培养上清液中的放射性量(这是蛋白质降解的指示)来诱导和定量自噬。为了控制由于其他途径引起的蛋白质降解,标准做法是比较使用或不使用自噬抑制剂处理的样品的降解率。虽然这种方法确实提供了自噬的定量测量,但它只测量整体自噬(而不是提供关于哪些蛋白质或细胞器正在被降解的更细粒度的细节),而且速度很慢。

  • 碱性磷酸酶活性:在酵母中PHO8编码液泡碱性磷酸酶的基因。正常情况下PHO8在内质网合成,通过分泌途径送到液泡,然后裂解生成活性形式的蛋白质。为了监测自噬,表达了Pho8Δ60突变蛋白。Pho8Δ60以非活性形式定位于细胞质,除非自噬被诱导。然后细胞质的非选择性巨自噬导致Pho8Δ60在液泡中积累,在液泡中被裂解生成一种活性酶。Pho8磷酸酶活性或Pho8分子质量从其未裂解形式向裂解形式的转移是该分析的最终结果。这也是自噬的定量测量,但是,像上面的蛋白质降解实验一样,它是缓慢的,并且只测量整体自噬。

形态分析

  • 电子显微镜电子显微镜是研究自噬的传统方法。这种方法依赖于基于形态学的自噬结构的识别。自噬体相对容易识别:含有未消化的胞质内容物的双膜结构。与液泡或溶酶体融合的自噬小体更难识别,因为它们的内容物可能处于不同的降解阶段。此外,电子显微镜分析是耗时的。

  • gfp标记的Atg8p或LC3:ATG8是一组影响自噬的基因的一部分(ATG在酵母)。Atg8p(“p”代表蛋白质)与自吞噬体膜有关,因此用GFP标记它可以跟踪酵母中前自吞噬体结构、自吞噬体和自吞噬体的定位或积累。一个gfp标记的LC3版本,哺乳动物Atg8p同源物,也可以用来监测自噬,但在某些条件下,它以自噬独立的方式聚集。此外,追踪Atg8p或LC3并不能提供关于自噬小体内容的信息,也不能提供关于在液泡或溶酶体中被降解的内容的信息,因为一旦自噬小体与液泡或溶酶体融合,Atg8p和LC3都被降解或释放。

罗塞拉荧光性质

罗塞拉生物传感器(右图)得名于一种澳大利亚鹦鹉(左图)

Rosella是一种双色发射生物传感器,以色彩鲜艳的澳大利亚鹦鹉命名。它由两个串联荧光蛋白组成:一个相对ph不敏感的RFP变体,伟德2021足球欧洲杯买球平台DsRed。T3和ph敏感的GFP变体,超黄道荧光素(SEP)。它们通过一个9个氨基酸连接到DsRed.T3的c端。Rosella的激发和发射光谱总结见表1。DsRed是Rosella的永久荧光标记部分:无论其在细胞中的定位如何,它都会发出红色荧光。SEP的pH敏感性意味着Rosella会发出绿色荧光,除非它在液泡或溶酶体等酸性环境中。根据Rosella的定位,其发出的颜色荧光如表2所示。

表1:罗塞拉的激发和发射光谱总结。

组件 发射 pH值范围
安全域。T3

488, 543*, 568 nm

587海里

~ 4.9 - 9

9月

488 *海里

508海里

~ 6.5 - 9

*由Rosado等人确定的最佳连续激发波长:关于pH值对Rosella荧光性质影响的更多细节见表2。

表2:定位对罗塞拉荧光发射的影响。

本地化 pH值 发射颜色
胞质

~ 7.5

红色的绿色
线粒体

~ 8

红色的绿色

液泡

~ 6.2

红色的

溶酶体 ~ 4.8 红色的

用Rosella研究酵母的自噬

当没有信号序列表达时,Rosella被靶向于细胞质,并通过柠檬酸合酶的线粒体靶向序列被靶向于线粒体。在正常生长条件下,这两种变异均被排除在液泡外,并发出红色和绿色荧光。氮饥饿4小时诱导自噬后,液泡中聚集红色荧光而非绿色荧光。图2显示了有和没有自噬的细胞质线粒体罗塞拉的荧光表现。在这两种情况下,随着暴露于自噬诱导条件的时间延长,液泡中的红色荧光增加。

左侧为酵母细胞质中表达的蔷薇,右侧为线粒体

Rosella通过追踪被运送到酵母液泡(即细胞质,线粒体)的东西,而不是追踪一般的自噬标记物,使得研究自噬背后的机制变得更容易。这对于比较自体自噬和线粒体自噬,即线粒体的靶向自噬特别有用。所示萨尔基扬等。这也可能使罗塞拉融合,从而监测你的蛋白质的自噬感兴趣。

你准备好试试罗塞拉了吗?这两个cytosol-targetedmitochondria-targeted变种可从Addgene。


参考文献

1.Rosado, C., Mijaljica, D., Hatzinisiriou, I., Prescott, M., & Devenish, R. J.(2008)。Rosella:一种用于报告酵母中细胞质和细胞器液泡周转的荧光ph生物传感器。自噬,4(2), 205 - 213。doi: 10.4161 / auto.5331。PubMedPMID: 18094608

2.Sargsyan, A., Cai, J., Fandino, L. B., Labasky, M. E., Forostyan, T., colsimo, L. K., Graham, T. E.(2015)。使用单一荧光生物传感器快速平行测量哺乳动物细胞的自噬和线粒体自噬。科学报告,5(1) doi: 10.1038 / srep12397。PubMedPMID: 26215030。公共医学中心PMCID: PMC4517063

3.Mizushima, N., Yoshimori, T., & Levine, B.(2010)。哺乳动物自噬研究的方法。细胞,140(3), 313 - 326。doi: 10.1016 / j.cell.2010.01.028。PubMedPMID: 20144757。公共医学中心PMCID: PMC2852113

4.Klionsky, D. J., Cuervo, a.m., & Seglen, P. O.(2007)。从酵母到人的自噬监测方法。自噬,3(3), 181 - 206。doi: 10.4161 / auto.3678。PubMedPMID: 17224625

5.野田,T., & Klionsky, D. J.(2008)。第三章:定量分析Pho8Δ60非特异性自噬。自噬的酶学方法:低等真核生物和非哺乳动物系统,A部分,33-42。doi: 10.1016 / s0076 - 6879(08) 03203 - 5。PubMedPMID: 19185711

Addgene博客上的其他资源伟德体育中心

更多资源请访问Addgene.org

主题:伟德2021足球欧洲杯买球平台,荧光生物传感器

留下你的评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅