基于CRISPR/Cas的SARS-CoV-2/COVID-19检测方法

由Guest Blogger.

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这篇文章由萨拉维蒂斯科什来自爱荷华州立大学。

自出现以来,SARS-CoV-2已扩散到世界几乎每一个地区,表现为全面的大流行。遏制这种病毒的传播已成为世界各国的首要任务,为此,世卫组织建议采取一项策略:检测、跟踪和保持社会距离。

与韩国这样的国家,爆发的早期震中之一最终弯曲曲线,已经变得明显,广泛的测试对于控制这种大流行是至关重要的。目前,CDC使用RT-QPCR测试来诊断Covid-19和一些血清学测试来确定过去的暴露。然而,试剂和设备的可用性有限,长期转变时间,导致研究人员转向其他技术,如Crispr。

CRISPR诊断测试的流程图,从病毒RNA以煅烧凝胶,侧向流动条或荧光可视化的读出开始
图1:基于CRISPR/Cas的COVID-19检测方法概述。

使用基于CRISPR的DETECTR技术快速检测2019新型冠状病毒SARS-CoV-2

灵敏度:每微升10-100份RNA副本

时间: ~ 40分钟

所需设备:37°C加热块和62°C热块

方法:将病毒RNA提取并通过靶向e和SARS-COV-2的N2基因的引物进行等温扩增。如果CAS12A-SGRNA复合物与靶序列结合,则CAS12A活性被激活。这释放出不分青红皂白的SSDNA切​​割活性,该活性切割供应的荧光标记的SSDNA底物。在切割时,荧光不再淬灭,可以使用横向流动条目视检测到。由于探针用链霉抗生物素蛋白标记,因此横向流动条首先通过生物素捕获探针的链霉抗生物素蛋白部分。切割的探针的荧光部分将继续流动并进一步沿着条带进一步捕获。

强调:在测试的83个已知的Covid阳性样品中,阳性预测率为95%和100%的负预测率。它也是到目前为止开发的最快测试。类似的方法已经过优化直接使用唾液检测SARS-COV-2病毒不需要进行RNA提取,但只有当有足够高的(105.每微升副本)唾液中的病毒载量(Lucia等,2020)。

使用基于CRISPR的Sherlock(特异性高灵敏度酶报告解锁)技术检测冠状病毒

灵敏度:可以检测到每毫升的单分子 - 在ZeptOmolar范围内

时间:〜1小时

设备要求:37°C水浴和42°C水浴

方法:使用市售扩增试剂盒从样品中提取RNA,并经受等温重组酶聚合酶扩增(RPA)的影响。在这种情况下,扩增基因S和ORF1ab基因的区域。RPA反应还含有逆转录酶以产生cDNA。等温扩增在一个恒定温度下进行,无需热循环仪。随后是体外转录,然后使用CAS13来检测扩增的感兴趣区域。CAS13使用互补CRRNA序列与样品结合,并在结合后,激活。该活化导致反式切割反应,其切割含有含有荧光团的附近RNA序列,该荧光团在切割时完整并释放。切割导致荧光,并且这种方法可以掺入允许快速检测的横向读出滑槽中。

强调:Cas13a在CRNA中的两个或更多个错配的存在下不催化活性:靶双链体,并且不会对高度相似的病毒产生阳性结果。与CAS12A不同,CAS13A不需要在目标站点上进行严格的序列偏好,而CAS12A则需要PAM(Protospacer相邻的图案),用于靶裂解。该测试可以分两步进行,如two - step - sherlock,或以快速、高通量的方式在一步中进行,如one - pot - sherlock。两步夏洛克的敏感度在齐普莫拉范围,而一步夏洛克的敏感度在飞起搏范围。有关这些方法之间差异的更多细节,请查阅这表

一体化双CRISPR/Cas12a (AIOD-CRISPR)检测——用于新型冠状病毒SARS-CoV-2的快速、超灵敏和可视化检测

灵敏度:40分钟孵育中,4.6-11拷贝/微升RNA靶标

时间:〜90分钟

需要设备:37°C热块,LED蓝光发光器或UV光照明器。

方法:与Sherlock诊断测试高度相似,该测试在步骤顺序和使用CAS蛋白的使用序列中变化。这里,将反应所需的所有组分在单一的一锅反应系统中混合并在一次温度下孵育。设计了两种CAS12A-CRRNA复合物,每个CAS12A-CRRNA复合物,每个结合到靠近底漆识别位点的反向转录的靶序列的一股并分开加入。使用与两个区域结合的两个CRRNA提高了测定的灵敏度。该反应还含有SSB,链位移DNA聚合酶,重组酶和在切割时表现出荧光的SSDNA-FQ记者。在通过RPA引物扩增时,CAS12A-CRRNA与靶序列中的互补区域结合,并且该活性导致SSDNA-FQ报道的跨裂解导致荧光。CAS12A结合所有扩增的靶区域并导致SSDNA-FQ记者的连续切割。可以在没有激发光,UV光或LED蓝光下观察所得到的荧光。

强调:这是一锅,一次性反应,几乎单分子敏感。在HIV-1和SARS-COV-2检测的情况下,无前置放大的AIOD-CRISPR能够检测到1.2拷贝DNA靶标和4.6拷贝的RNA靶标在40分钟内孵育。

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可扩展,易于部署的CAS13检测的SARS-COV-2遗传物质(CREST)

灵敏度:每微升的10个RNA拷贝

时间:本文未提及,可能大约1-2小时

需要设备: DIY-Bio微型PCR机,P51纸板荧光显像仪,9V电池

方法:此预印刷品使用先前开发的方法检测样品中的SARS-COV-2。首先,提取RNA并受逆转录。然后使用Taq聚合酶通过PCR扩增该,然后转录以提供Cas13的RNA基材。CAS13在发现GRNA和给定的荧光标记的衬底之间的互补后,被激活并进行非特异性的抵押裂解。该裂解与荧光可视化偶联。然而,在该技术中,代替使用横向流动条检测荧光标记的RNA的切割,代理商使用P51纸板荧光可视化器,该P51纸板荧光可视化器由使用蓝色LED和橙色过滤器使用的9V电池供电,以检测在切割时检测荧光。

强调:通过PCR而不是RPA扩增逆转录的RNA样品。与RPA不同,该技术使用Taq聚合酶,其广泛可用,更便宜。作者而不是使用典型的PCR机器,而不是使用实惠的现场就绪,使能够是电池的蓝牙的PCR机器,可以通过DIY-BIO运动来获得。

使用FNCAS9(Feluda)快速,现场部署的核碱基检测和识别

灵敏度: - 110飞摩尔

时间:没提到,大概1-2个小时吧

需要设备:PCR机/热块,侧面流动条,琼脂糖凝胶设备,荧光发射读卡器

方法FnCas9编辑链统一检测(FELUDA)是一种使用FnCas9的技术,FnCas9是一种对DNA和这些错配的位置高度敏感的蛋白质。采用生物素化引物PCR/RPA扩增目标序列,检测SARS-CoV-2核酸。然后用链霉亲和素包被的小球固定。荧光标记的dCas9复合物包含没有错配的sgRNA结合到固定的目标序列。结合后,可以看到荧光的变化。另一种方法是将相同的概念应用于包含链霉亲和素的横向流动条带,它可以结合到生物素化的目标。他们还试图确认琼脂糖凝胶上的靶标结合,在琼脂糖凝胶上,如果正确结合,裂解反应会产生两条条带,而不是没有裂解的单条条带。

强调:为了检测非PAM区域,可以将PAM设计到引物中。这种方法不依赖于酶的侧枝切割,而是依赖于其对目标区域的活性,从而使其成为一种基于亲和的方法。由于FnCas9的错配敏感性,这也是一种诊断单核苷酸变异的好方法。此外,FnCas9可在10-50℃的温度范围内裂解。

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Shravanti Suresh头像

非常感谢来自爱荷华州立大学的客座博主Shravanti Surest。

Shravanti Suresh是爱荷华州立大学Sashital实验室的博士生,研究CRISPR/Cas免疫系统的细胞方面。她对科学传播和使发展中国家能够获得科学非常感兴趣。你可以关注她的推特@shra_krishna。

参考

Azhar,M.,Phutela,R.,Ansari,A.H.,Sinha,D.,Sharma,N.,Kumar,M.,... Maiti,S。(2020)。使用FNCAS9快速,现场部署的核碱基检测和识别。https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167

Broughton JP, Deng X, Yu G, Fasching CL, Servellita V, Singh J, Miao X, Streithorst JA, Granados A, Sotomayor-Gonzalez A, Zorn K, Gopez A, Hsu E, Gu W, Miller S, Pan C-Y, Guevara H, Wadford DA, Chen JS, Chiu CY (2020) CRISPR–Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nature Biotechnology.https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4

Kellner MJ,Koob Jg,Gootenberg Js,Abudayyeh Oo,Zhang F(2019)Sherlock:核酸检测用Crispr核酸酶。自然协议14:2986-3012。https://doi.org/10.1038/s41596-019-0210-2

Lucia,C.,Federico,P.-B.,&Alejandra,G.C。(2020)。基于CRISPR-CAS12的超敏感,快速,便携式冠状病毒SARS-COV-2序列检测方法。冷泉港实验室。https://doi.org/10.1101/2020.02.29.971127

RAUCH,J.N,Valois,E.,Soley,S.C.,Braig,F.,Lach,R.S。,Baxter,N.J.,Kosik,K.S.,Arias,C.,Acosta-Alvear,D.,&Wilson,M.Z.(2020)。(2020)。(2020)。可扩展,易于部署,用于基于CAS13的SARS-COV-2遗传物质的检测。冷泉港实验室。https://doi.org/10.1101/2020.04.20.052159.

使用CRISPR技术检测COVID-19的方案https://www.broadinstitute.org/files/publications/special/covid-19%20detection%20(updated).pdf.

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话题:CRISPRCAS蛋白新冠肺炎

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