节省时间暂时植物叶片变换

由Guest Blogger.

这篇职位由撒母耳莫尔·莫尔森森是东北大学博士候选人贡献。

与工厂合作并不总是一个耗时的过程。虽然在组织培养中培育出转基因毛状根系需要半年时间,而培育出转基因植物则需要更长的时间,但一个短暂的植物叶片转化过程可以为植物生物学家节省一些时间……实际上是几个月。

Catharanthus roseus也叫工厂在里面Lee-Parsons实验室我们正在研究癌症治疗药物长春碱和长春新碱的生产在药用植物中是如何调控的Catharanthus Roseus.(图1)。我们研究的最终目标是在植物或植物组织培养中增强其生产。

C. Roseus.不是模型生物,如拟南芥或烟草。研究基因功能C. Roseus.通过方法的可用性受到强烈限制。感染根出杆菌根草杆菌可在组织培养中培养出稳定的毛状根系。这种方法常用于C. Roseus.但是,在毛状根中不能研究特定于光合活性组织的过程,因为根部缺少官能叶绿体和叶片特异性细胞类型。转基因毛状根的发展至少六个月。产生转基因植物需要更长时间,更劳动,效率更低,效率低,并且通常不会再现。在创建转基因培养物或植物之前,我们的瞬时表达方法使我们能够快速筛选和研究转录因子候选和基因在生物合成途径中的调控。

为什么植物科学家做瞬态叶片变换

转基因植物的发展是非模型生物中的常见问题。因此,瞬态方法通常是研究基因功能的首选,因为这些实验可以在几天到几周而不是几个月。在植物科学中“瞬态转化”通常意味着既不从转化的组织中再生稳定的细胞系或植物。基因函数通常通过瞬时沉默和/或过度表达植物感兴趣的基因来研究。

沉默基因的常用方法

病毒诱导基因沉默(VIGS)是一种瞬态技术,利用病毒和植物的转录后机制来沉默感兴趣的基因(Unver和Budak, 2009)。这个方法很管用C. Roseus.

过表达基因的常用方法

在植物拟南芥和烟草,农杆菌进入叶片的浸润是过表达基因的简单有效的方法,并评估其功能。在自然界农杆菌含有含有T-DNA(转移dna)区域的质粒。在感染过程中,这个T-DNA区域被转移到植物中。在实验室中,我们可以利用这一自然过程,用我们感兴趣的基因或报告基因替换T-DNA区域上的基因,这样就可以跟踪转化和基因表达。在短暂的叶片转化过程中,工程农杆菌将菌株与叶组织接触,并且将感兴趣基因的T-DNA区域转移到细胞中。但对于C罗斯斯,农杆菌渗入树叶的效果并不好,由于叶子具有蜡质质地并且难以渗透。

我们最近克服了这个问题C. Roseus.通过与幼苗一起工作,优化瞬变过程的其他几个方面(Mortensen等,2019)。我们的方法可以为其他物种的瞬态转换系统提供一些有用的指导方针。

在开发瞬态叶片变换方法时要考虑的事情农杆菌:

如果您对该领域的新手,以下是第一个瞬态叶片转换的有用提示:

检查您的物种是否有工作协议

这将为您节省大量时间。不要重新发明轮子。

测试不同的叶子年龄

通常年轻的叶片工作得更好。不是每一片叶子都同样容易发生短暂的变化。

选择良好的报告基因

有很多很棒报告基因可用,您选择哪一个取决于您的实验(De Ruijter等,2003)。例如,我们对GUS基因进行了初步转换,以了解转型是否成功。一旦我们在正确的轨道上,我们就转向荧光素酶以更容易地量化不同治疗对转化成功的影响。一些报告基因实施例如下。

  • GUS基因(β-葡萄糖醛糖苷)组织化学的GUS染色是一个非常有用的视觉记者(图2)。GUS酶切割底物,然后将形成蓝色沉淀物。GUS通常是建立新的转化协议的首选,因为它很容易显示转化的组织。但小心:检查组织的GUS样活动。运行控制农杆菌缺乏GUS基因,因为植物可以有内源性GUS-like活动(胡等人,1990)。我们通常使用pSB161 - pL2_pSB90_2x35S::格斯::载确认转换成功。
  • 荧光素酶是伟大的定量报告,并使用底物产生生物发光。例如,荧光素酶的mRNA和蛋白质半衰期通常比GUS短,因此是测量启动子活性的很好的时间报告因子。有用的阳性控制包括:psb96 - pl2_psb90_2x35s :: fluc-i :: tnos&psb166 - pl2_psb90_tmas :: rluc-i :: pmas
  • 伟德2021足球欧洲杯买球平台可以在许多方面使用荧光蛋白(FP,例如GFP)。通常,FP融合给感兴趣的蛋白质,以阐明您感兴趣的蛋白质的亚细胞定位。

查找来自Lee-Parsons实验室的所有质粒。

组织化学的GUS染色玫瑰花幼苗

测试不同的叶片渗透方法

  • 共同栽培(Li et al., 2009):共同培养农杆菌凭借你的叶子是一种非常易于转化的方法,但在许多物种中可以效率低下。更高效是注射器或真空浸润。
  • 注射器渗透(D'Aoust et al., 2009):通常使用没有针头的注射器注射农杆菌通过气孔培养到叶片的背面(下表面)。这是一种简单且易于实现的技术。不同的实验者成功与否可能有所不同。
  • 真空渗透(Mortensen等,2019):叶子或整株植物放在一个农杆菌用真空钟或干燥器施加溶液和真空。通过沉没组织通常可以看到成功的渗透(参见图3)。此方法可能是最可扩展的方法。工厂瞬态转化真空渗滤法

将植物转移到黑暗中转型前16小时

我们通常在转化前16小时将植物转移到黑暗中,然后在转化后再让它们在黑暗中待两天。

使用内含子

植物启动子可以被识别或渗漏农杆菌。与报告基因特别有问题,因为您可能会观察到表达式农杆菌,但不是植物。例如,我们看到了强烈的表达格斯具有常用CAMV 35s启动子的基因农杆菌。这可以很容易地通过使用内含子来避免,内含子可以从植物的转录本中移除,但不能从植物中移除农杆菌

测试不同农杆菌菌株

我们使用了解除武装根癌土壤杆菌菌株GV3101(PMP90),适用于我们。

使用一个良好的工作矢量系统

这允许您快速组装向量并测试不同的想法。我们是超级粉丝基于金门的MoClo系统上面提到的该博客文章中提到的矢量可以使用载体,但是使用Moclo系统,您可以轻松快速地创建定制向量。有关植物Moclo的更多信息,请查看此项采访Nicola Patron,谁分享了MoClo植物试剂盒通过Addgene

对我们来说,短暂的叶片转化对于筛选候选基因和加快研究速度有很大的帮助。当然,还有更多的瞬时叶变换,但我们希望这些技巧可以帮助您开始。一旦你在你的实验室建立了一个良好的工作协议,它可以成为你的研究的一个强有力的工具。请在下方评论添加更多的技巧和经验。

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非常感谢我们来自东北大学的客座博主Samuel Mortensen。

塞缪尔·莫滕森东北植物生物学塞缪尔·莫特森是马萨诸塞州波士顿东北大学的博士候选人。他在从汉诺威汉诺威(德国)之前,他在植物生物技术中获得了BSC和MSC,然后在开始工作之前Lee-Parsons实验室

参考

D'aoust,Marc-André,等。“使用注射器农药植物中抗体的瞬时表达。”植物重组蛋白。人类出版社,2009. 41-50。PubMedPMID: 19183892

De rujter, n.c.,等人。用于植物基因表达研究的GUS、LUC和GFP报告系统的评价和比较植物生物学5.02(2003):103-115。

胡庆叶等。种子植物中固有的GUS-like活性植物细胞报告9.1(1990):1-5。PubMedPMID:24226366

Lee,Min Woo和Yinong Yang。“通过叶子的农毒滤成瞬态表达测定。”拟南芥协议。人类出版社,2006. 225-229。PubMedPMID:16739580

李,建胜等。“快速技术:拟南芥幼苗和其他植物物种中瞬态基因表达分析的简化农杆菌转化方法。”植物方法5.1(2009): 6。PubMedPMID: 19457242。公共医学中心PMCID:PMC2693113

莫滕森,塞缪尔等人。EASI转化:一种分析Catharanthus roseus幼苗基因功能的高效瞬时表达方法植物科学前沿10(2019)。PubMedPMID:31263474。公共医学中心PMCID:PMC6585625

Unver,Turgay和Hikmet Budak。“病毒诱导的基因沉默,后转录基因沉默方法。”国际植物基因组学杂志2009年(2009年)。PubMedPMID:19547658。公共医学中心PMCID:PMC2699436.

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