CRISPR基因分型的测序选择

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这篇职位由剑桥大学的生物化学博士候选人提供宾客博客·斯伦霍夫贡献。

CRISPR实验过程中最重要的步骤之一是验证编辑。无论您使用哪种CRISPR基因组编辑系统,仍然有机会是观察到的表型是由偏离靶突变引起的,而不是靶基因中的编辑。

验证过程,也称为CRISPR基因分型,对于证明基因型和检测表型之间的因果关系是至关重要的。验证这些连接可以帮助缓解再现性危机在生物学。随着CRISPR在生命科学领域的应用不断增长,为学术界、产业界、特别是临床建立标准化验证技术是解决这些问题的关键。

流行的验证测定不足

讨论了在CRISPR 101:验证你的基因组编辑在美国,CRISPR基因分型有多种选择。最常见的方法包括错配裂解分析,如Surveyor™、T7E1和Sanger测序。然而,最近的研究表明,对于验证编辑,Surveyor™和Sanger可能都不是足够的标准。

错配切割测定依赖于宿主DNA的编辑链和野生型链之间的配对。当这些链杂交时,核酸酶可以检测到不匹配的链并将它们切割。然后使用凝胶电泳将结果可视化。

Surveyor™和T7E1由于其相对简单和低成本而被广泛采用。这些分析的问题是它们不能提供序列级数据。它们的检出限为~5%。这意味着他们不能可靠地检测到在少于5%的人群中发生的编辑事件(Fu等人,2013,Vouillot等人,2015)。

与此同时,Sanger测序费力、耗时且不能应用于异质群体(Bell等人,2014)。此外,Sanger测序具有较低的50-20%的检测限(尽管在一些研究中这已得到改善)(Davidson等人,2012,Tsiatis等。2010年)。由于该领域朝着标准化阈值移动,用于验证CRISPR实验,许多人正在转向较旧的测定上的下一代测序选项。

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偏置测序方法

脱靶检测主要有两种方法:有偏检测和无偏检测。有偏差的技术只对基因组中预测包含脱靶裂解事件的特定位点进行测序。不带偏见的技术搜索整个基因组的脱靶位点,而不考虑在网上预测。

这些技术在很多重要方面有所不同,但也可以通过提供基因组测序的广泛和具体的细节来相互补充。这些方法一起使用,可以为研究人员提供一个合理的水平,当然,他们看到的影响不是由于脱靶。这是提高研究结果的可信度和可重复性的有价值的一步。

表1:偏见的基因分型选项

技术 序列信息 检测限 好处 缺点
乳沟不匹配分析 没有提供 5% 廉价,简单 低通量,敏感性低
桑格测序 提供 20%(变量) Sequence-level数据 低通量,不适合异质群体,低敏感性
有针对性的扩增子测序 提供 0.01%(变量) 序列级数据,非常敏感 不排序所有的dsb,可能错过不可预测的脱靶突破

预测算法:一个开始偏见验证的好地方

目前,许多软件工具利用计算方法预测sgRNAs的脱靶效应。他们根据基因组和sgRNA的序列确定基因组中可能的脱靶位点,并精确定位错配位点。对于大多数研究人员来说,这是一个很好的起点,因为它提供了一个假定的脱靶位点的列表,他们以后可以对这些位点进行突变排序。

研究人员可以使用一种方法来测试CRISPR实验后预测的脱靶位点是靶向扩增子测序。来自靶向扩增子测序的信息是高度敏感的,检测水平低至0.01% (Hendel等人,2015)。低检出率意味着研究者可以相对确定,如果他们的样本使用这些技术不被发现,他们不会有脱靶突变。

脱靶突变的频率是研究人员寻找确定的基因型和表型联系的基本数据点。在转译研究人员开始使用CRISPR作为一种治疗方法时,执行这些验证也是关键。低频脱靶效应可能在研究环境中产生不可复制的数据,但这些事件可能在临床中产生灾难性的健康影响。基于ngs的方法提供关于假定脱靶点的最完整的信息概要,包括编辑率和修复产品序列。

靶向扩增子测序并不能说明一切

无偏的测序方法尽管使用离目标预测算法进行了进展,但它们的基因组视图标准并非详尽无遗。不匹配的公差设置通常限于<4 bp的偏离目标站点。偏离目标列表通常在终端3'PAM网站上的更严格的序列要求沿GRNA的长度(Fu等人,2013;Pattanayak等人,2013)。

这种方法忽略了更大的不匹配(例如6个核苷酸),这些不匹配仍然可能导致脱靶双链断裂(Tsai等人,2015)。此外,目前的算法没有考虑到其他因素,包括那些与DNA结构有关的因素(例如,表观遗传修饰,隆起),这些因素也可能影响脱靶编辑。因此,只有传统算法预测的测序位点可能无法提供CRISPR编辑对模型细胞系或生物体影响的全图。

无偏差脱靶检测有几种选择,包括双基因组序列(Kim等人,2015)在体外分析,IDLV for在活的有机体内检测(Gabriel等人,2011,Wang等人。2015年,奥斯本等人。2016年)和htgts(Frock等人,2015年)进行细胞实验。这些策略可以协同使用在网上预测创建更全面的非目标编辑事件列表。两种基于细胞的方法是通过测序评估评估(引导-SEQ)评估的基因组宽的双链断裂(DSB)的基因组宽的识别(Tsai等人,2015)和直接原位打破标记,富集链霉抗生物素蛋白和下一代测序(祝福)(祝福)(Crosetto等人,2013)。

指南和祝福检测双链断裂,不需要高音测序读取计数,使其在许多实验室中的多路复用测序进行快速和可行的选择。然而,无偏见的检测与靶向扩增子测序不敏感。例如,指南-SEQ似乎具有0.1%的最小检测限(Tsai等人,2015)。这种对比频率为0.01%的扩增子测序(Hendel等人,2015),随着CRISPR实验的显着差异,更接近诊所(Tsai和Joung 2016)。

表2:无偏倚基因分型选择

技术 检测限 应用 好处 缺点
指南SEQ. 0.1% 基于细胞的 搜索基因组的所有dsb,不需要高读取计数,快速多路复用 需要递送dsODN(潜在毒性)
Digenome Seq 0.1% 无细胞(体外) 在所有细胞类型上工作 必须用基于单元格的方法进行验证吗
idlv. 1% 基于细胞的 可编程,可以检测直播中的DSB 不像其他无偏方法那样灵敏,高背景
保佑 没有报告 基于细胞的(体外) 可用于来自整个动物模型的组织,不需要外源性组分(例如DSODN),不需要高读数(快速复用) 需要大量的细胞群,细胞固定后对时间敏感
HTGTS 没有报告 基于细胞的 标识易位 受染色质结构限制,产生许多假阴性

结合测序技术可以确保验证的实验

无偏见的检测方法对于在整个基因组中寻找DSB的证据。然而,它们降低的灵敏度意味着前进的最佳选择可以是集成偏置和非偏见的方法。如审查所建议的Tycko等人,2016,无偏的测序和在网上预测应该提供基因组中所有可能的编辑事件的大图片;在此基础上,扩增子测序可以以高度准确的方式评估和验证脱靶位点。

对于每个CRISPR实验来说,使用这两种方法可能都不是必要的。>3 bp错配或序列无关的脱靶事件是罕见的,但它们可以通过全基因组无偏性方法检测到。然而,大多数研究人员使用单细胞克隆在体外CRISPR实验。来自池的单个单元克隆同时包含罕见的脱靶事件和所需编辑的可能性很低。因此,当选择单个克隆时,无偏测序可能不值得付出成本和劳动力。相反,转化研究可能需要严格的两种脱靶分析形式,以满足临床批准。

在该领域寻求就生物系统中遗传网络的作用产生可重复的高质量数据时,保持一套一致的标准是关键。NGS还将在临床治疗领域发挥重要作用,因为CRISPR不仅用于疾病研究,还用于治疗患者。关于上述测序技术的更多信息和详细概述,请参见《优化CRISPR-Cas9基因组编辑特异性的方法》Tycko等人,2016以及“定义和改进CRISPR-Cas9核酸酶的全基因组特异性”
Tsai和Joung 2016


非常感谢我们的客座博主SørenHough。我们还感谢Monica Sendmanat,Victor Dillard和Ayokunmi Ajetunmobi对此工作的贡献。

Hough Soren GURDON先生2019SørenHough是剑桥大学史蒂夫·杰克逊教授的生物化学博士候选人。在实验室之外,他作为自由撰稿人的自由撰稿人和科学作家,专注于科学的方式可以用来创造一个更加公平和公平的社会。阅读更多https://杂志。sciencyforthepeople.org/

参考

1.付艳芳,等。"人类细胞中CRISPR-Cas核酸酶诱导的高频脱靶突变"自然生物技术31.9(2013): 822 - 826。PubMedPMID: 23792628。公共医学中心PMCID:PMC3773023

2.Vouillot,Léna,AuroreThélie和尼古拉斯殖民地。“T7E1和测量仪失配裂解测定检测由工程核酸酶引发的突变的比较。”G3:基因|基因组|遗传学5.3(2015): 407 - 415。PubMedPMID:25566793。公共医学中心PMCID: PMC4349094

3.贝尔,查尔斯C.等人。“使用下一代测序检测CRISPR-CAS9诱导突变的高吞吐量筛选策略。”BMC基因组学15.1(2014):1。PUBMEDPMID:25409780.。公共医学中心PMCID:PMC4246457

戴维森CJ。等。“改善Sanger测序的检测限:KRAS变体检测方法的比较。”生物技术53.3(2012):182-188。PubMedPMID:22963480。公共医学中心。

5.Tsiatis, Athanasios C.等。Sanger测序、焦磷酸测序和KRAS突变检测融解曲线分析的比较:诊断和临床意义。分子诊断学杂志12.4(2010):425-432。PubMedPMID:20431034。公共医学中心PMCID:PMC2893626

6.亨德尔、亚尔等。“量化目标上和目标外的基因组编辑。”生物技术的发展趋势33.2(2015): 132 - 140。PubMedPMID:25595557。公共医学中心PMCID:PMC4308725

7.Pattanayak, Vikram等人。“脱靶DNA裂解的高通量分析揭示了rna编程的Cas9核酸酶的特异性。”自然生物技术31.9(2013):839-843。PubMedPMID: 23934178。公共医学中心PMCID: PMC3782611

8.蔡胜达,等。“GUIDE-seq使全基因组通过CRISPR-Cas核酸酶实现脱靶切割。”自然生物技术33.2(2015):187-197。PubMedPMID: 25513782。公共医学中心PMCID: PMC4320685

9。Kim Daesik等。“基因序列:人类细胞中CRISPR-Cas9脱靶效应的全基因组分析。”自然方法12.3(2015):237-243。PubMedPMID:25664545.

10。Gabriel,Richard等人。“对锌 - 手指核酸酶特异性的无偏见基因组分析。”自然生物技术29.9(2011):816-823。PubMedPMID: 21822255

11.王,小林,等。“使用整合酶缺陷的慢病毒载体,通过CRISPR-CAS9和TALENs对脱靶切割的无偏见检测。”伟德BV下载自然生物技术33.2(2015): 175 - 178。PubMedPMID: 25599175

12.奥斯本,马克J等。TALENs、CRISPR/Cas9和megaTAL核酸酶对TCR基因编辑的评价分子治疗(2015)。PubMedPMID:26502778.

13.Frock,Richard L.等人。“由工程核酸酶诱导的DNA双链断裂的基因组检测。”自然生物技术33.2(2015):179-186。PubMedPMID: 25503383。公共医学中心PMCID: PMC4320661

14.Crosetto,Nicola等人。“下一代测序的核苷酸分辨率DNA双链断裂映射。”自然方法10.4(2013): 361 - 365。PubMedPMID: 23503052。公共医学中心PMCID: PMC3651036

15.Tsai,Shengdar Q.和J. Keith Joung。“定义和改善Crisp-Cas9核酸酶的基因组特异性。”自然遗传学评论17.5(2016): 300 - 312。PubMedPMID: 27087594

16.Tycko, Josh, Vic E. Myer和Patrick D. Hsu。优化CRISPR-Cas9基因组编辑特异性的方法分子细胞63.3(2016):355-370。PubMedPMID:27494557

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