CRISPR 101:胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑器

由玛丽传动装置

最初发布于2016年8月16日,最后更新了詹妮弗·曾任2020年8月6日。云顶娱乐 韦德国际

当我们谈论CRISPR应用程序时,一个负面往往提出:低编辑效率同源导向修复(HDR)。相比非同源终端连接,HDR发生在相对较低的频率下,并且在不均匀的细胞中,进一步下调该途径。科学家而不是试图改善HDR,已经开发了两类基础编辑器:胞嘧啶基础编辑器(CBE)和腺嘌呤基础编辑(ABES)。

(还有RNA基础编辑器,但我们只会在这里涵盖DNA基础编辑器。要了解有关RNA基础编辑的更多信息,请参阅此博客文章:CRISPR 101:RNA编辑CAS13

什么碱基可以编辑?

CBES介导C至T的变化(或G到相反股线的变化)。ABES使A到G的变化(或者在相反的股线上改变)。这仅占12个可能的变化中的四种。

最近,发展Prime编辑,它使用不同的机制而不是CBE或ABES,来自大卫刘的实验室可以让科学家做出所有12种可能的碱基对碱基的改变。

基础编辑如何工作?

碱基编辑需要三个要素。广泛:

  1. CA酸酐或CAS融合到使编辑的脱氨酶
  2. 将CAS瞄准CAS到特定基因座
  3. 用于在CAS蛋白指定的编辑窗口内进行编辑的目标基础

这些元素是从博士后Alexis Komor的第一个胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器发展的起点妮可Gaudelli.在大卫刘2016年的实验室。

胞嘧啶基础编辑

胞嘧啶碱基编辑的开始

Komor创造了第一个细胞苷基础编辑器通过将胞苷脱氨酶与失活的dCas9偶联(Komor et al., 2016)。这些融合将胞嘧啶转化为尿嘧啶而不切割DNA。尿嘧啶随后通过DNA复制或修复转化为胸腺嘧啶。将尿嘧啶DNA糖基化酶(UGI)抑制剂与dCas9融合,可防止碱基切除修复,使U变回C突变。为了提高碱基编辑效率,你需要一种方法迫使细胞使用脱氨的DNA链作为模板。为此,该实验室使用了Cas nickase,而不是dCas9。由此产生的编辑器BE3将未修改的DNA链刻痕,使其在细胞中看起来像是“新合成的”。因此,细胞用含有u的链作为模板来修复DNA,复制碱基编辑。

胞嘧啶碱基编辑示意图。gRNA与cas9 -胞苷脱氨酶融合,形成复合物并与靶标结合。胞苷脱氨基使自由链上的C变为U。错配修复保留编辑如果被修改的链作为模板。
胞苷脱胺在自由束上进行DNA,并将C至U转化为U,而不产生双链断裂。

BE3系统将人类细胞系中各种靶标的编辑频率提高到30%以上,平均编辑频率仅为1.1%。与cas9介导的HDR相比,这些数字是一个巨大的进步,HDR介导的平均编辑频率仅为0.5%,并且更多的indels被观察到,而不是点修饰。CRISPR碱基编辑通过多次细胞分裂持续进行,表明这种方法产生稳定的编辑。然而,基于Cas9脱靶活性,本系统也存在脱靶编辑问题。

点击此处查找CRISPR基础编辑质粒

改善胞嘧啶​​基础编辑范围和效率

自BE3的发展以来,许多研究团体已经改进了基础编辑,包括:

  • 扩大目标范围
  • 提高编辑效率
  • 降低偏离目标效果

2016年,Akihiko近藤的实验室创建了目标艾滋病基本编辑器使用a从海拉彭霉素融合到Cas9酸氨酶的胞嘧啶脱氨酶(Nishida等,2016)。目标辅助行为类似但与BE3相同,修改PAM上游的3-5个基本窗口18基础。

David Liu的实验室用其他脱甜酶产生了Be3变体:AID,CDA1和APOBEC3G(Komor等人。,2017年)。CDA1-BE3和AID-BE3被编辑的CS比BE3更有效,但APOBEC3G显示了更少可预测的序列偏好。

刘实验室还使用自然和工程的Cas9变体来发展具有不同PAM序列的五个新的基础编辑器,增加碱基编辑可用目标站点的数量(Kim等人,2017)。对于每个碱基编辑器,他们观察到最小编辑效率为~50%的编辑活性,并证实融合蛋白保留了Cas9个体的PAM特性。他们还使碱基编辑器的胞苷脱氨酶部分发生突变,创建了SpCas9碱基编辑器,编辑窗口小至1-2个核苷酸。

为了减少与碱基编辑相关的脱靶效应,实验室Rees等人创建了HF-BE3,一个碱基编辑器包含高保真CAS9变体HF-CAS9(REES等,2017)。HF-BE3显示出37倍的偏离目标编辑,只能略微降低目标编辑效率。为了进一步改善特异性,它们纯化HF-BE3蛋白以将核糖蛋白蛋白(RNP)递送至斑马鱼胚胎和小鼠内耳。

第四代基础编辑

第四代基础编辑器,Be4,减少不需要的C-> G或C->可以使用BE3的转换。在基础切除修复期间,这些副产物可能由Uracil N-糖基酶(UNG)切除。添加了UGI的UGI的第二份拷贝,增加了基础编辑产品纯度。该实验室还扩展了Apobec1-CAS9N和CAS9N-UGI链接器以提高产品纯度,这三种改进代表了第四代基础编辑器。与BE3相比,BE4提供2.3倍的C-> G和C->产品,以及诱导形成的2.3倍。

为了进一步减少indel形成1.5-2倍,该团队融合了噬菌体蛋白Gam到BE4的n端(Komor等,2017)。Gam与dsb的自由端结合,这可能导致细胞死亡而不是NHEJ修复,从而将这些细胞从编辑的群体中移除。

改善哺乳动物编辑的基本编辑效率的另一种方法是确保编辑器使其进入核心,并且它们表示良好。刘实验室修改了核定位信号和密码子用法BE4创建be4max和Ancbe4max.在编辑效率的改善4.2-6倍(Koblan等,2018)。

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腺嘌呤基编辑

腺嘌呤基本编辑的开头

来自David Liu的Lab的Nicole Gaudelli创建了一个adenine基础编辑器将腺嘌呤转化为肌苷,导致A转化为G(Gaudelli等,2017)。创建腺嘌呤基础编辑器需要额外的步骤,因为没有已知的DNA腺嘌呤脱氨酶。他们使用指向的演变来从RNA腺嘌呤酶TADA中创建一个。

经过七轮分子演进后,他们获得了四个腺嘌呤基础编辑(ABES)。ABE7.10是最活跃的编辑器,使用目标位置4-7的编辑窗口显示53%的平均编辑效率。eBES 6.3,7.8和7.9显示略较较宽的位置4-9的编辑窗口,尽管在第8和9号位置的编辑效率可能更低。而胞嘧啶基础编辑器经常产生混合的编辑群,APE不会显示出显着的A.-g目标基因座的转换。从DNA中除去肌苷可能不常见,从而防止诱导基础切除修复。

在脱靶效应方面,ABEs也优于其他方法。在与Cas9的头尾对比中,Cas9修改的9/12已知脱靶率为14%,而ABE7.10修改的4/12已知脱靶率为1.2%。虽然该实验室没有对ABE特异性进行全面的全基因组研究,但他们的其他实验表明ABE是强大的但具体的编辑器。

改善腺嘌呤基础编辑

当刘实验室创建的BE4MAX和ANCBE4MAX上面时,它们还制作了一种具有改善的核定位和表达的腺嘌呤基础编辑器。这个基本编辑器被命名abemax.

在2020年,发布了两篇论文,描述了从ABE7.10演变的额外的APE,其具有改进的基础编辑器,其针对灵活性和特异性。在这首先,刘实验室使用了噬菌体辅助演化选择系统来产生Abe8e(TADA-8E v106W),这编辑速度比ABE7.10的TadA快590倍不增加偏离目标活动(Richter等,2020)。这很重要,因为雅培一般都很慢这意味着Cas9结构域经常在编辑完成前离开DNA。

使用ABE7.10作为起点,高德利将基本编辑器演变为40个新的Abe8变体(Gaudelli等,2020)。与abe7.10相比,ABE8s结果表明,与ABE7.10相比,NGG PAM的原间隔子位置A5-A7的编辑量增加了1.5倍,A3-A4和A8-A10的编辑量增加了3.2倍,而非NGG PAM的编辑效率则提高了4.2倍。abe8有一个改进的碱基编辑能力,即使是在以前很难定位的位置。ABE8s可以在原代T细胞中实现98-99%的靶标修饰,使其成为a有前途的工具用于细胞治疗应用

双基础编辑器

把两个编辑器的功能结合在一起怎么样?这是最近通过将腺嘌呤和胞嘧啶编辑组件融合在一起完成的。

基思·荣格的实验室发明了一种双脱氨酶编辑器空间(同步可编程腺嘌呤和胞嘧啶编辑器)融合MiniaMemax-V82G和对Cas9的目标辅助(Grünewald等,2020)。另一位实验室采取了类似的方法。Dali Li的实验室的A&C-Bemax包括一个融合胞苷和腺苷脱氨酶使用Cas9镍酶(Zhang等,2020)。与ABEmax相比,它增加了CBE活性,减少了RNA脱靶活性。

基本编辑出版物亮点

出版物 质粒 强调
Komor等人。,2016年 Be1,Be2,Be3 BE3的编辑效率最高,但在地层中的编辑效率高于BE2
Nishida等人。,2016年 目标艾滋病 编辑3-5围绕PAM上游的-18位置
Kim等人,2017年 SABE3,BE3 PAM变体,BE3编辑窗口变体 极大地扩展了碱基编辑的目标位点数量
Rees等,2017年 HF-BE3 HF-BE3和核糖核蛋白传递降低BE3脱靶活性
Komor等人。,2017年 be4和be4-gam;AID,CDA1和APOBEC3G BE3变体 UGI的第二份副本提高了产品的纯度。Gam减少indel频率。
Koblan等人。,2018年 be4max,arcbe4max,abemax 改善了核定地化和表达
Gaudelli等。,2017年 腺嘌呤基础编辑(ABE7.10) A->I (A->G)编辑,产品纯度高,脱靶率低
Richter等人,2020年 Abe8. 590x更快的腺嘌呤基础编辑比abe7.10
Gaudelli等人。,2020年 ABE8e 在主小区中有效编辑
Zhang等人,2020 A&C-Bemax 具有胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑
Grünewald等人。,2020年 空间 具有胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑

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参考文献

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