CRISPR 101:胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑器

由玛丽传动装置

最初出版于2016年8月16日,最后更新于2020年8月6日,作者是Jennifer Tsang。云顶娱乐 韦德国际

当我们谈论CRISPR应用时,一个负面因素经常出现:编辑效率低homology-directed修复(HDR)。相比非同源终端连接,HDR发生在相对较低的频率下,并且在不均匀的细胞中,进一步下调该途径。科学家而不是试图改善HDR,已经开发了两类基础编辑器:胞嘧啶基础编辑器(CBE)和腺嘌呤基础编辑(ABES)。

(也有RNA碱基编辑器,但我们这里只讨论DNA碱基编辑器。想了解更多关于RNA碱基编辑器的信息,请访问这篇博客:CRISPR 101:RNA编辑CAS13)

什么碱基可以编辑?

cbe介导C到T的变化(或G到对链上a的变化)。ABEs使A变为G(或在相反的链上由T变为C)。这只占了12个可能变化中的4个。

最近,发展Prime编辑,它使用不同的机制而不是CBE或ABES,来自大卫刘的实验室允许科学家们使所有12个可能的基础变化。

基础编辑如何工作?

碱基编辑需要三个要素。广泛:

  1. CA酸酐或CAS融合到使编辑的脱氨酶
  2. 将CAS瞄准CAS到特定基因座
  3. 用于在CAS蛋白指定的编辑窗口内进行编辑的目标基础

这些元素是从博士后Alexis Komor的第一个胞嘧啶碱基编辑器和腺嘌呤碱基编辑器发展的起点妮可Gaudelli于2016年在David Liu的实验室里。

胞嘧啶基地编辑

胞嘧啶碱基编辑的开始

Komor创造了第一个胞嘧啶碱基编辑器通过将胞苷脱氨酶与失活的dCas9偶联(Komor et al., 2016)。这些融合将胞嘧啶转化为尿嘧啶而不切割DNA。尿嘧啶随后通过DNA复制或修复转化为胸腺嘧啶。将尿嘧啶DNA糖基化酶(UGI)抑制剂与dCas9融合,可防止碱基切除修复,使U变回C突变。为了提高碱基编辑效率,你需要一种方法迫使细胞使用脱氨的DNA链作为模板。为此,该实验室使用了Cas nickase,而不是dCas9。由此产生的编辑器BE3将未修改的DNA链刻痕,使其在细胞中看起来像是“新合成的”。因此,细胞用含有u的链作为模板来修复DNA,复制碱基编辑。

胞嘧啶碱基编辑示意图。gRNA与cas9 -胞苷脱氨酶融合,形成复合物并与靶标结合。胞苷脱氨基使自由链上的C变为U。错配修复保留编辑如果被修改的链作为模板。
胞苷脱胺在自由束上进行DNA,并将C至U转化为U,而不产生双链断裂。

BE3系统对人细胞系中各种目标的编辑频率提高到高于30%,平均诱导频率仅为1.1%。这些数字是对Cas9介导的HDR的巨大改进,用于在平均HDR介导的编辑频率仅为0.5%的情况下测试的基因座,并且观察到比点修改更多的诱导。CRISPR基础编辑仍然存在于多个单元划分,表明该方法产生稳定的编辑。然而,该系统也基于Cas9偏移目标活动的偏移目标编辑。

点击这里找到CRISPR碱基编辑质粒

提高胞嘧啶碱基编辑范围和效率

自BE3的发展以来,许多研究团体已经改进了基础编辑,包括:

  • 扩大目标范围
  • 提高编辑效率
  • 减少非目标效应

在2016年,Akihiko近藤的实验室创建了目标艾滋病使用从海拉彭霉素融合到Cas9酸氨酶的胞嘧啶脱氨酶(Nishida等,2016)。目标辅助行为类似但与BE3相同,修改PAM上游的3-5个基本窗口18基础。

David Liu的实验室通过其他脱氨酶:AID, CDA1和APOBEC3G (Komor等人,2017)。CDA1-BE3和AID-BE3被编辑的CS比BE3更有效,但APOBEC3G显示了更少可预测的序列偏好。

刘实验室也使用自然和工程Cas9变种发展五个新的带有不同PAM序列的碱基编辑器,增加碱基编辑可用目标站点的数量(Kim等人,2017)。对于每个碱基编辑器,他们观察到最小编辑效率为~50%的编辑活性,并证实融合蛋白保留了Cas9个体的PAM特性。他们还使碱基编辑器的胞苷脱氨酶部分发生突变,创建了SpCas9碱基编辑器,编辑窗口小至1-2个核苷酸。

为了减少与碱基编辑相关的脱靶效应,实验室Rees等人创建了HF-BE3,一个碱基编辑器包含高保真CAS9变体HF-CAS9(REES等,2017)。HF-BE3显示出37倍的偏离目标编辑,只能略微降低目标编辑效率。为了进一步改善特异性,它们纯化HF-BE3蛋白以将核糖蛋白蛋白(RNP)递送至斑马鱼胚胎和小鼠内耳。

第四代基础编辑

第四代基础编辑器,Be4,减少不需要的C-> G或C->可以使用BE3的转换。在基础切除修复期间,这些副产物可能由Uracil N-糖基酶(UNG)切除。添加了UGI的UGI的第二份拷贝,增加了基础编辑产品纯度。该实验室还扩展了Apobec1-CAS9N和CAS9N-UGI链接器以提高产品纯度,这三种改进代表了第四代基础编辑器。与BE3相比,BE4提供2.3倍的C-> G和C->产品,以及诱导形成的2.3倍。

为了进一步减少indel形成1.5-2倍,该团队融合了噬菌体蛋白GAM到BE4的N-末端(Komor等,2017)。Gam与dsb的自由端结合,这可能导致细胞死亡而不是NHEJ修复,从而将这些细胞从编辑的群体中移除。

提高哺乳动物碱基编辑效率的另一种方法是确保编辑器能够进入细胞核并得到良好表达。刘实验室修改了核定位信号和密码子使用Be4创建BE4max和AncBE4max编辑效率提高了4.2-6倍(Koblan et al., 2018)。

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腺嘌呤基础编辑器

腺嘌呤基本编辑的开头

David LIu实验室的Nicole Gaudelli发明了一种腺嘌呤碱基编辑器将腺嘌呤转化为肌苷,导致A转化为G(高德利等,2017)。创建一个腺嘌呤碱基编辑器需要一个额外的步骤,因为没有已知的DNA腺嘌呤脱氨酶。他们用定向进化的方法从RNA腺嘌呤脱氨酶TadA中制造了一个。

经过七轮分子演进后,他们获得了四个腺嘌呤基础编辑(ABES)。ABE7.10是最活跃的编辑器,使用目标位置4-7的编辑窗口显示53%的平均编辑效率。eBES 6.3,7.8和7.9显示略较较宽的位置4-9的编辑窗口,尽管在第8和9号位置的编辑效率可能更低。而胞嘧啶基础编辑器经常产生混合的编辑群,APE不会显示出显着的A.-g目标基因座的转换。从DNA中除去肌苷可能不常见,从而防止诱导基础切除修复。

在脱靶效应方面,ABEs也优于其他方法。在与Cas9的头尾对比中,Cas9修改的9/12已知脱靶率为14%,而ABE7.10修改的4/12已知脱靶率为1.2%。虽然该实验室没有对ABE特异性进行全面的全基因组研究,但他们的其他实验表明ABE是强大的但具体的编辑器。

改善腺嘌呤基础编辑

Liu实验室在创建上述BE4max和AncBE4max时,也制作了具有改进核定位和表达的腺嘌呤碱基编辑器。这个基本编辑器被命名为ABEmax

2020年,发表了两篇论文,描述了从ABE7.10进化而来的附加的ABEs,这些ABEs改进了碱基编辑器的灵活性和特异性。首先,Liu实验室使用噬菌体辅助进化选择系统生成Abe8e(TADA-8E v106W), 哪一个编辑比ABE7.10的速度快〜590倍不增加脱靶活动(Richter等人,2020年)。这很重要,因为雅培一般都很慢意味着Cas9域通常在编辑之前允许去DNA。

使用abe7.10作为起点,Gaudelli将基本编辑器演变为40个新的Abe8变体(高德利等人,2020年)。ABE7.10相比,Abe8s.在与ABE7.10相比,在Protospacer位置A5-A7和A8-A10的位置A5-A7和3.2倍以上的编辑,在非NGG PAM变体上进行更高的效率为1.5倍。即使在以前难以定位的网站,ABE8S也具有改善的基础编辑能力。ABE8S可以在初级T细胞中达到98-99%的目标修饰,使其成为一个有前途的工具用于细胞治疗应用

双基地编辑

把两个编辑器的功能结合在一起怎么样?这是最近通过将腺嘌呤和胞嘧啶编辑组件融合在一起完成的。

Keith Joung的实验室创建了一个调用的双达群酶编辑器空间(同步可编程腺嘌呤和胞嘧啶编辑器)将miniABEmax-V82G和Target-AID熔合到Cas9(Grünewald等,2020年)。另一个实验室采用了类似的方法。李大力实验室的A&C-BEmax由胞苷脱氨酶和腺苷脱氨酶的融合用Cas9酸酐(Zhang等,2020)。与ABEMAX相比,它增加了CBE活性和降低了RNA偏离靶向活动。

基本编辑出版物亮点

出版物 质粒 突出了
Komor等人,2016 BE1、BE2 BE3 BE3的编辑效率最高,但在地层中的编辑效率高于BE2
Nishida等人,2016 目标艾滋病 编辑3-5基窗口周围-18位置PAM上游
Kim等人,2017年 SABE3,BE3 PAM变体,BE3编辑窗口变体 大大扩展了基本编辑的目标基因座的数量
Rees等人,2017年 HF-BE3 HF-Be3和核糖核蛋白蛋白递送降低Be3偏移活性
Komor等人,2017 be4和be4-gam;AID,CDA1和APOBEC3G BE3变体 二级的UGI副本改善了产品纯度。GAM降低indel频率。
Koblan等人,2018 BE4max、ArcBe4max ABEmax 改进核定位和表达
Gaudelli等。,2017年 腺嘌呤基础编辑(ABE7.10) a-> i(a-> g)编辑高产品纯度和低离心编辑
Richter等人。,2020年 ABE8 590x更快的腺嘌呤基础编辑比abe7.10
高德利等人,2020年 Abe8e. 高效编辑主单元格
张等人。,2020年 A&C-Bemax 具有胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑
Grünewald等,2020年 空间 具有胞嘧啶和腺嘌呤基础编辑

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参考

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