不需要羊驼-合成纳米体对抗膜蛋白

来自骆驼的纳米级已经得到了很多新闻对于Covid-19的治疗或预防的有希望的方法。研究人员确定nanobodies与冠状病毒刺突蛋白结合(Wrapp等人，2020年)，刺突蛋白位于冠状病毒表面，使病毒能够进入宿主细胞。为了做到这一点，他们在几天内将来自两种不同冠状病毒的刺突蛋白注入骆驼体内，并分离出特殊的骆驼抗体，这些抗体在细胞培养中与刺突蛋白结合，并抑制这些病毒。

但是Llama免疫有其缺点：它需要一个骆驼醛动物设施，可以昂贵的是常规获得昂贵的，并且在试图开发抗膜蛋白等膜蛋白的不稳定靶标的抗体时可能尤其具有挑战性（以骆驼）高体温（37.2 - 39.2°C）。Seeger实验室通过使用质粒来找到这种方法产生Sybodies，合成纳米型对抗刺突蛋白(Walter等，2020)。不需要骆驼。

合成纳米体的优点

纳米级是小（12-15 kDa）单结构域蛋白，可有效结合蛋白质靶标，类似于抗体如何做。常见抗体的结构是Heftier（〜150kDa）和Y形，因为它含有两个大的重链和两个小光链，粘在形成与特异性抗原结合的高度可变区的“臂”。相反，纳米甲基是一种衍生自称为重链抗体（HCAB）的骆驼抗体的单个重型结构域片段。由于它们的体积小，可以在细菌中综合表达纳米粒细胞，并且它们可以靶向抗体的表位，如将隐藏在细胞表面上的分子裂缝蛋白中的抗体的表位。

图1：常见抗体，HCAB和纳米谱的比较。有关更多信息，请阅读我们的次要纳米型博客帖子。

针对膜蛋白生成共体的快速选择平台

开发针对膜内蛋白质的抗体是很棘手的，因为它们的亲水性表面更少，需要洗涤剂或脂质保持折叠，而且通常比其他一些蛋白质含量更少。西格实验室开发了一种健壮的体外协议能够在短短3周内针对膜蛋白目标快速选择合成纳米体(称为sybodies) (Zimmermann等人，2020年)。该选择平台的设计使任何标准实验室都可以快速选择目标膜蛋白的共体使用Sybody代工具箱商业上可获得的试剂分三个主要步骤——所有这些都不需要找到一个羊驼农场!

要查找最佳绑定的系统，您希望从大型和多样化的Sybodies开始，假设对目标蛋白质强烈粘合的池。Seeger Lab设计了3个不同的MRNA Sybodic图书馆，用于协议，涵盖3个自然发生的纳米曲面结构（凹形，环路和凸）。这些3 mRNA文库中的每一个都具有凹形，环或凸起支架，并且在与抗原结合的区域中，用定义的不同三核苷酸（对应于不同的氨基酸）随机化。Seeger Lab可以直接以MRNA的形式提供学术研究的三个系统图书馆。

用于生成自己的库的模板质粒也可以在Sybody生成工具箱质粒工具包中找到:sb_concave.那sb_loop.那sb_convex.。这些支架含有可在职位的丝氨酸和苏氨酸随机创建库(Zimmermann等人，2018)。

找到Sybody Generation Toolbox！

从文库和生物素化（用于纯化目的）的感兴趣的蛋白质目标，该方案通过3个主要步骤来选择最佳的候选人。

图2：针对膜蛋白的共体选择过程的概要。从图片Zimmermann等人。，2018年。

核糖体展示

Seeger实验室从使用核糖体显示器的“预富集”选择步骤开始，因为它具有较大的初始起始库大小（最多10个）的优势^12.成员）与使用噬菌体和酵母的其他显示系统相比（10^9.-10年^10.成员）。该选择步骤涉及使用商业试剂盒进行MRNA文库的体外翻译。图书馆中的每个mRNA分子不能编码止芯密码子，这使得核糖体在mRNA分子的末端暂停，形成由翻译的蛋白质（体内），核糖体和mRNA组成的核糖体复合物。在筛选过程中，可以回收与生物素化靶蛋白结合的显示的Sybodies用于随后的步骤。

噬菌体展示

来自富集的Sybody候选者的mRNA被逆转录成有效亚克隆到噬菌体中的cDNA片段pdx_init.质粒,使用片段交换(FX)克隆技术使用IIS类型限制站点(Geertsma, 2013)。一旦噬菌体被构建，它们就被用来产生一个噬菌体库，由噬菌体组成，这些噬菌体在它们的外壳蛋白中显示候选共体，以筛选与目标蛋白的结合。该方案描述了通过两轮噬菌体展示来增加目标特异性sybody的富集。

通过酶联免疫吸附试验（ELISA）最终富集

来自噬菌体展示屏幕的丰富的Sybody池被亚克隆（使用FX克隆）进入表达载体PSB-Init.，它将myc标签和his6标签附着在每个sybody候选人的末尾。这些标签在最后的富集步骤中用于识别与目标蛋白强烈而特异地结合的共体。Seeger实验室使用了上述ELISA技术在他们的协议中因为它易于识别非特异性和低亲和力的Sybodies（Zimmermann等，2020）。该协议的该步骤从与ELISA板结合的抗Myc抗体开始，以捕获Myc标记的Sybodies。然后，加入生物素化的靶蛋白并在几次洗涤后，使用比色反应检测结合。

在ELISA步骤之后，测序狭窄的池（通常为10-30）候选物被测序以进行鉴定。所有独特的Sybodies都可以括起来pBXNPH3或者pBXNPHM3表达质粒用于生产无标签蛋白，用于进一步表征和分析。

在对Covid-19大流行的快速反应中，Seeger实验室证明他们可以使用该协议迅速识别和孤立Sybodies靶向SARS-CoV-2受体结合域的膜结合棘突蛋白，在显著的12个工作日。虽然该实验室将这种方法用于COVID-19研究，但该方案有望开发其他疾病的治疗方法或研究其他膜结合蛋白。

可以找到此系统选择平台的完整协议在这里相关的质粒在Sybody Generation工具箱。

找到西格实验室的SARS-CoV-2病毒携带者!

参考

• GEERTSMA ER（2013）FX克隆：一种多功能高通量克隆系统，用于酶变体表征。在：分子生物学中的方法。人类新闻，第133-148页。https://doi.org/10.1007/978-1-62703-293-3_10
• Walter J等人(2020)针对SARS-CoV-2受体结合域的合成纳米体。生物XIV。https://doi.org/10.1101/2020.04.16.045419。
• Wrapp D，De Vlieger D，Corbett Ks，Torres Gm，Wang N，Van Baseam W，Roose K，Van Schie L，Hoffmann M，PöhlmannS，Graham BS，Callewaert N，Schepens B，Saelens X，Mclellan JS（2020）单结构域骆驼抗体具有含贝葡萄球菌的结构基础。电池181：1004-1015.E15。https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.04.031
• Zimmermann I，Egloff P，Hutter Caj，Kuhn Bt，BräuerP，纽斯特德S，道森RJP，Geertsma Er，Seeger Ma（2020）产生了对精致蛋白质的合成纳米型。自然协议15：1707-1741。https://doi.org/10.1038/s41596-020-0304-x
• Zimmermann I, Egloff P, Hutter CA, Arnold FM, Stohler P, Bocquet N, Hug MN, Huber S, Siegrist M, Hetemann L, Gera J, Gmür S, Spies P, Gygax D, Geertsma ER, Dawson RJ, Seeger MA(2018)用于膜蛋白构像捕获的合成单域抗体。eLife 7:。https://doi.org/10.7554/elife.34317

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