人工合成启动子aav在视网膜细胞中特异性表达

由贝丝学会主席

adeno相关病毒(AAV)是一个流行的基因交付工具,但它有一个缺点:您如何确保您的基因在您需要它的位置?知道基因以特定的细胞类型表达是重要的,不仅是转化研究,例如基因治疗,还是基础研究。为了提高AAV的细胞类型特异性,工作已经专注于修饰病毒的外部蛋白质壳或衣壳,因此它只进入并将其递送到某些细胞类型。

Botond Roska的实验室在分子和临床眼科基塞尔研究所最近采用了不同的方法来增强视网膜细胞的特异性。这样做,小组开发了一种寻找视网膜细胞类型特异性启动子的新策略。大多数现有的促进剂在广泛的细胞类型中表达,例如抑制神经元,棒,锥体或视网膜神经节。Roska实验室从划伤中建立了合成启动子并测试了它们在视网膜中推动细胞型特异性表达,而不是使用自然发生的启动子以驱动转基因表达,而是通过划痕构建的合成启动子。

设计合成启动子的四种方法

为了建立一个合成启动子库,Roska实验室使用了四种不同的设计策略:

  • 策略#1(PROA):在来自小鼠的视网膜细胞类型特异性基因的起始密码子上游创建具有序列的启动子。
  • 策略# 2(概率):使用至少两个高表达和高细胞型特异性基因转录起始位点上游的系统发育保守序列创建启动子。
  • 策略#3(proc):通过重复用随机序列分开的小鼠细胞类型特定转录因子结合位点来创建启动子。
  • 策略#4(产品):在帮助下创建促销员表观遗传分析并使用在小鼠视网膜细胞类型中具有转录活性的DNA片段进行设计。
设计合成AAV启动子的策略
图1:设计合成启动子的四种策略。图例:TSS:转录起始位点。TFBS:转录因子结合位点。从图片Jüttner等,经许可,2019年

总共,该文库含有226 AAV,各自具有不同的合成启动子推动同一转基因的表达:致硫化报道,通道治疗,融合于荧光GFP标记物(Catch-GFP)。实验室存入AAV质粒含有Addgene的活性促进剂

人工合成启动子aav在小鼠体内的表现

首先将所有这些合成的启动子AAV注入小鼠的眼中以测试GFP的细胞类型特异性表达。在注射后四周以视网膜细胞表达的一半(113)和14%在特定细胞类型(前:杆或锥体)或细胞类别(例如包括杆和锥体的光感受器)中的靶向表达。

靶向表达定义为至少满足以下条件之一:

  • 超过90%的表达发生在一种类型的细胞中
  • 在一种细胞中发生超过50%的表达,其余表达仅在Müller胶质细胞中发生,瞄准AAV的常见污染
  • 超过70%的表达来自一类细胞

在四种不同的启动子设计中,策略4的启动子具有最高的靶向表达率。令人惊讶的是,小于1%的合成启动子复制了野生型启动子的表达特异性。合成启动子,然而,倾向于松散匹配源基因的特异性,即如果一个合成启动子表达在细胞外视网膜的一部分,它更可能借来的元素从一个自然的启动子是活跃在外层视网膜的一部分。

找到AAV合成启动子质粒!

比较合成启动子在小鼠、猴子和人类视网膜上的表现

接下来,将113个活跃在小鼠视网膜中的AAV启动子注射到猕猴和死后的人类视网膜中。大约25%的AAV合成启动子成功地针对猴子和人类视网膜的细胞。通过比较这三种启动子的表现,Roska实验室得出结论,启动子在小鼠中针对某一类细胞的能力,并不能很好地预测NHPs (R=0.38)和人类(R=0.32)中针对同一类细胞的能力。但是,启动子在所有三种物种中针对同一细胞类别的几率仍然大于随机概率。启动子在灵长类和人类视网膜中表达而在小鼠中不表达的几率很低(R=0.12),这表明小鼠可以用来消除在灵长类和人类中也不太可能表达的启动子。另一方面,AAV针对猴子细胞类别的能力是针对人类相同细胞类别的良好预测因子(R=0.67)。

一个显微镜图像数据库的所有aav可重复标记视网膜细胞可以找到在这里

合成启动子AAV的应用

除了限制特定细胞类型或类别的AAV转基因表达外,这些合成促进剂还有一些其他潜在应用:

  1. 使用促进剂组合进行有针对性的表达:虽然少数合成的启动子靶向特异性细胞类型,但是可以使用对合成促进剂对基于表达的促进剂中的细胞类型中的重叠限制表达到单细胞系。实验室使用一个启动子测试了这种申请,以驱动CRE的表达。MCHERRY和第二促进剂,以驱动CRE依赖性荧光捕获GFP记者的表达。GFP的表达只会导致Cre-MCHERRY也表达的细胞。如果CRE-MCHERRY在感光体和水平细胞中表达,并且在水平细胞和神经节细胞中表达CRE依赖性-GFP,则只有由AAV转导的水平细胞将表达CRE-MCHERRY和GFP。
    配对合成启动子
    图2:合成启动子可以配对进行靶向表达。

    该相同的合成促进剂也用于靶向多种细胞类型,并且还可用于稀疏标记神经元以进行追踪实验。

  2. 神经跟踪实验虽然具有高标记率的合成启动子是基因治疗的理想应用,但产生稀疏标记的启动子将对神经元追踪实验有用,在这种实验中,较低标记水平的启动子更容易追踪神经元的投射。

  3. 生成动物模型:转基因动物允许在特定组织中表达基因,但它们是昂贵且耗时的产生,特别是对于例如最大的大型动物。伟德BV下载具有细胞类型特异性启动子的病毒载体可能是限制动物模型中基因兴趣表达的更简单的方法。

合成AAV启动子的工具包

ROSKA实验室的合成启动子AAV允许在视网膜细胞类型和小鼠,灵长类动物和人类视网膜中的靶向基因表达。这些合成启动子是基本的有价值的工具以及基因治疗的翻译研究。Roska实验室希望设计当前推广程序的改进版本,以及更多针对当前文库中缺失的细胞类型的启动子(Neff等人,2019)。虽然在视网膜细胞中进行了测试,但同样的设计原则可以用于在其他组织中合成细胞型靶向表达的启动子。

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参考文献

Juettner, J., Szabó, A., Gross-Scherf, B., Morikawa, R.K., Rompani, S.B., Hantz, P., Szikra, T., Esposti, F., Cowan, c.s., Bharioke, A., Patino-Alvarez, C.P., Keleş, Ö。, Kusnyerik, A., Azoulay, T., Hartl, D., Krebs, A., Schübeler, D., Hajdú, r ., Lukáts, Á。那Németh, J., Nagy, Z.Z., Wu, K., Wu, R., Xiang, L., Fang, X., Jin, Z., Goldblum, D., Hasler, P.W., Scholl, H.P., Krol, J., & Roska, B. (2019). Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience, 22, 1345-1356.https://doi.org/10.1038/s41593-019-0431-2

Neff,E.P.小鼠,猕猴和人类视网膜细胞表达的AAV文库。Lab Aim.48,264(2019)。https://doi.org/10.1038/s41684-019-0380-0

话题:伟德BV下载细胞追踪AAV.

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