标记光学机构和中间体受体:荧光蛋白和其他选择伟德2021足球欧洲杯买球平台

由Guest Blogger.

这篇职位由埃默里大学医学院副教授Adriana Galvan提供贡献。

光学性和嗜源性是强大的工具,用于调节神经元和其他脑细胞的活性。由于这些技术中使用的OPSIN或化学受体不能直接用荧光或免疫组织化学方法可视化,因此这些蛋白质常规融合到'标签'或'标签'蛋白促进其检测。

伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白是最广泛使用的标签,因为它们发出了易于检测的内源性荧光,以适当的荧光照明在体内,exvivo或后验尸实验。伟德2021足球欧洲杯买球平台也可以使用抗体和免疫组织化学技术鉴定荧光蛋白。因此,这些蛋白质提供了一种通用的方法,以鉴定感兴趣的转基因的表达。此外,荧光团变体(例如绿色和红色荧光蛋白)允许同时鉴定多于一种感兴趣的蛋白质。伟德2021足球欧洲杯买球平台

然而,在我们的经验中,我们发现荧光蛋白可能并不总是最好的选择。伟德2021足球欧洲杯买球平台

伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白可以干扰融合蛋白质功能

在某些情况下,融合的荧光蛋白可以是障碍的障碍,而不是助剂,在感兴趣的蛋白伟德2021足球欧洲杯买球平台质中。绿色荧光蛋白(GFP)和MCHERRY,目前使用的两种最常见的标签,大约为240个氨基酸。这些蛋白质的大小或它们之间的二聚体可能会影响融合蛋白的性质或贩运(Kimple等,2013)。

我们发现荧光蛋白确实干扰了感兴趣的蛋伟德2021足球欧洲杯买球平台白质的正确功能。在我们的研究中,我们使用AAV病毒载体伟德BV下载表达HM4DI.在神经元恒河猴或小鼠(Galvan等,2019)。这HM4DI受体是一个工程师G一世蛋白质偶联受体, 其中一个设计师受体专门由设计师药物激活(Dreadds)(Armbruster等,2007)。

我们最初使用的结构是将hM4Di与mCherry融合在一起。为了研究hM4Di的定位,我们使用了针对mCherry的一抗和偶联纳米金粒子的二抗,这使得蛋白质定位具有高空间分辨率。令人惊讶的是,我们在电子显微镜下的观察显示,在猴子神经元中,大部分的金颗粒在树突的细胞质中,只有一小部分在质膜上(图1的上半部分)。当然,这是有问题的,因为DREADD受体需要位于质膜上,在给药后由DREADD致动器激活。虽然我们发现小鼠神经元的细胞膜上有较大的比例,但大部分仍是细胞质。

使用“小”标签来识别蛋白质

鉴于HM4DI-MCHERRY在猴神经元的血浆膜中的表达有限,我们接下来假设与HM4DI融合的不同标签可能改善该DREADD的传输到质膜。这Haemagglutinin(HA)标签是流感病毒的血红素凝集素的小9氨基酸表位,以三十年前的融合蛋白领域引入(Field等,1988)。因此,我们在小鼠和猴子的大脑中注射了携带HM4DI-HA的AAV。令人惊讶的是,我们发现这种小变化产生了很大的差异。用HA标签替换MCHERRY导致两种物种(图1中的底板)中的血浆膜中HM4DI的丰富表达。

我们的结果表明,标签蛋白可能对膜中感兴趣的转基因的表达及其本地化具有重要影响。我们从这些研究中学到的教训是标签蛋白可以影响感兴趣的转基因的表达。在我们的研究中,MCHERRY干扰了恐惧膜的运输。在不需要荧光的研究中,使用HA和其他短表位标签(KIMPLE等,2013)可以帮助改善膜的蛋白质的运输。

电子显微照片显示HM4DI标记,剩余的细胞质和HM4DI-HA标签定位于质膜。

图1:电子显微镜图像显示HM4DI在猴子中的超微结构定位。预先嵌入的Imungold技术用于揭示与MCHERRY(顶部)或HA标签(底部)偶联的HM4DI。图像显示了猴子amygdala的树枝状(蓝色色调)的例子。红色和绿色箭头分别分别占据细胞质中的金颗粒或与血浆膜结合。注意,使用HA标签显着改善了HM4DI的传输到质膜。

我们的研究提供了一些荧光蛋白可以在某些情况下有害蛋白质的表达。伟德2021足球欧洲杯买球平台然而,我们还发现这不完全融合蛋白质。例如,我们看到另一种类型的Dreadd,HM3DQ,即使在融合到MCHerry时也成功地在质膜上表达。但我们的数据确实突出了仔细表征转基因表达的重要性。

我应该使用哪个标签?

在决定适当的标签时,实验设计应该是主要指导。我们的研究结果表明,当荧光不是必需的荧光蛋白不是必不可少的时,非荧光标签可能是有利的,以鉴定OPSIN或化学受体的表达。伟德2021足球欧洲杯买球平台然而,在某些情况下,荧光信号对于实验至关重要。由于融合蛋白可以代表患者蛋白质的成功表达的障碍,因此可以通过OPSIN或化学受体的荧光蛋白的双顺反应性表达IRES或2A序列。在这种情况下,蛋白质没有融合。标签蛋白将在同一细胞中表达,但不一定在与OPSIN或化学受体相同的亚细胞室。这可能不是许多研究中的一个重要限制,并且甚至可以在某些类型的实验中有益(例如,当神经泡中表达的荧光隐藏鉴定表达OPSin的细胞时)。

为了在制作荧光蛋白融合时要记住其他事情,请查看Joachim Goedhart在Addgen博客的文章:伟德体育中心伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白101:GFP融合蛋白 - 制造正确的连接

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Adriana Galvan爆头谢谢我们的博客!

Adriana Galvan是埃默里大学医学院和Yerkes国家灵长类动物研究中心的研究员副教授。使用组合体内和解剖技术,她的研究旨在更深入地了解运动障碍中基底神经节的生理和病理学。

参考资料

参考

Armbruster BN,Li X,Pausch MH,Herlitze S,Roth BL(2007)演变锁定拟合钥匙以产生由惰性配体纯粹活化的G蛋白偶联受体系列。国家科学院的诉讼程序104:5163-5168。https://doi.org/10.1073/pnas.0700293104

Field J,Nikawa J,Broek D,Macdonald B,Rodgers L,Wilson Ia,Lerner Ra,Wigler M(1988)纯化RAS响应腺苷酸环酶复合物酿酒酵母酿酒酵母通过使用表位添加方法。Mol Cell Biol 8:2159-2165。https://doi.org/10.1128/mcb.8.5.2159

Galvan A,Raper J,Hu X,ParéJ,Bonaventura J,Richie CT,Michaelides M,Mueller Sal,Roseom Ph,Oler Ja,Kalin NH,Hall Ra,Smith Y(2019)猴子中Dreadd S的超微结构定位。EUR J Neurosci 50:2801-2813。https://doi.org/10.1111/ejn.14429

Kimple Me,Brill al,Pasker RL(2013)蛋白质纯化的亲和标签概述。蛋白质科学的当前方案73:。https://doi.org/10.1002/0471140864.ps0909s73

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