NanoLuc®荧光素酶支持的技术

客人的博客

Guest Blogger.

这篇文章由Promega的Kyle Hooper贡献。

自从有质粒可共享以来,研究人员就一直在共享质粒。当我还在实验室的时候,如果你读了一篇论文,看到了一个你想要使用的有趣的结构,你可以自己做,也可以“通过电话克隆”。我的一位教授在电话克隆方面非常出色,他在世界各地的实验室都有实验室,他有获得他想要的质粒的具体策略和战术。Addgene使得在不同的实验室间分享你的结构变得更加容易。Promega支持addgene使命陈述:通过改善对有用的研究材料和信息的获取,加速研究和发现。我们的许多技术平台喜欢HaloTag®融合蛋白,密码子优化的萤火虫荧光素酶基因(例如,Luc2.), 和Nanoluc®Luciferase.可从存储库中获取。我们鼓励人们去加入addgene以获得新的创新工具。毕竟,我们分享时的科学不是更好的?

NanoLuc荧光素酶工程

NanoLuc®荧光素酶基于工具的技术可以加速你的研究。NanoLuc®荧光素酶的创建从相当沉闷的19kDaOplophorus.Promega先进技术组的荧光素酶以及普罗姆加化学集团更稳定但更稳定的富硫嗪的进化是一个好故事(1)。从深海虾到生物发光的小型发电站,NLuc比我们更常见的荧光素酶(如萤火虫(FLuc))亮100倍Renilla(Rluc)荧光素酶。这对您能够做出反应的光明来说,这不是很重要,但是对于您能够做出反应的敏感性。Nluc需要100倍较少的蛋白质来产生来自熔丝或Rluc反应的相同量。事实上,Nluc足以检测通过CRISPR / CAS9敲入产生的内源标记基因。最后,Nluc对内源性蛋白质标记非常诱人,因为它仅为19 kda。一个例子是Crispaint-nluc构建体(质粒# 67178),用于Schmid-Burgk, j.l.等(2)。

在这篇文章中,我将介绍NLuc技术的两个伟大应用。第一种是将NLuc与荧光蛋白结合制成更好的报告基因,伟德2021足球欧洲杯买球平台第二种是将NLuc与荧光蛋白结合制成更好的生物传感器。

下载荧光蛋白101电子书伟德2021足球欧洲杯买球平台

NanoLuc®-荧光蛋白融合成像

伟德2021足球欧洲杯买球平台神奇的成像工具,但它们的用途是有限的吗在活的有机体内因为它们必须被外部光源激发。这些外部光源可以产生自身荧光,由于被组织吸收,穿透受限。为了避免含血红素蛋白在整个动物体内的吸收,应使用波长在600 nm或以上的光。

研究人员经常使用生物发光来克服这些问题,因为传统的荧光素酶在近最佳波长(烙印率为610nm)并且不需要外部光源。不幸的是,检测传统的荧光素酶的昏暗光排放需要长时间的采集时间,对于某些实验设置可能是不切实际或不可行的。

Nluc的亮度引起了想要进行全动物成像的研究人员的注意,然而,Nluc的发射峰处于460nm,因此在体内成像中使其不适。

解决方案是将Nluc与红换萤石耦合。这里,Nluc内部通过称为生物发光谐振能量转移(BRET)的过程进行氟。然后,氟在300nm以上的组织渗透波长下发光。

LumiFluors

肖布等人(3.)设计了两个成像探头。一个由NLuc融合到增强的绿色荧光蛋白(GpNluc)组成,另一个由NLuc融合到渗透性更强的橙色荧光蛋白融合(OgNLuc)组成。这两种荧光伟德2021足球欧洲杯买球平台蛋白都可以被Nluc发射激发,实验室将这些融合称为LumiFluor报告。LumiFluor报告基因被设计成用于宿主细胞感染的逆转录病毒。通过流式细胞术,利用BRET报告基因的荧光部分对成功感染/表达的细胞进行分类。将分离的细胞注射到小鼠体内,并在i.p.或i.v.给药后成像。GpNLuc和OgNLuc BRET报告基因在没有外部刺激的情况下都产生了明亮的信号,而OgNLuc是最亮的,因为它的发射波长接近600纳米——这清楚地证明了为什么BRET报告基因可以改善深层组织成像。GPNLUC和OGHLUC的构建体可通过Addgene(Cat。#7018570186分别)。

LumiFluor记者

心大星

Chu, J.等人(4),同样地,想要制造一个用于成像的BRET探针。这些作者开始设计一个更好的荧光蛋白,可以与GFP共同成像使用相同的波长的激发。结果得到了可激发青色的橙色荧光蛋白CyOFP1。CyOFP1从mneptun2进化而来,经过33个突变和2个缺失。与类似的橙色荧光蛋白相比,CyOFP1具有更高的量子产率、亮度和成熟时间。伟德2021足球欧洲杯买球平台在他们的工作中,作者注意到CyOFP1是如何被NanoLuc®荧光素酶(NLuc)激发的,并着手通过连接两个CyOFP1分子到NLuc (CyOFP1-NLuc-CyOFP1;心大星)。在该模型中,将Antares或萤火虫荧光素酶质粒直接注射到小鼠肝脏,24小时后静脉注射呋马嗪或荧光素,Antares发出的信号比Fluc亮2倍以上。Antares的构造可以通过Addgene (Cat。#74279.)。

心大星

增强型纳米灯

铃木等人(5)使用荧光蛋白(FPs)同时在活细胞中成像多个蛋白质可能存在问题,因为激发光会导致光毒性、自身荧光和干扰生物现象。伟德2021足球欧洲杯买球平台FPs与荧光素酶偶联的技术可以克服这些问题,但由于偶联荧光素酶产生的微弱信号而受到阻碍。这种策略首先是通过RLuc8实现的Renilla荧光素酶,生产一系列FP-RLuc8融合物用于多色成像。在所有这些融合中,coelenterazine激发荧光信号,这些FP-RLuc8融合被称为纳米灯笼。

RLuc8比RLuc亮5.5倍,但NLuc比RLuc8亮30倍(6)。Susuki,K等人。因此,用Nluc取代了纳米灯笼中的Rluc8部分,称为他们改进的纳米灯。这些伟大的成像工具产生青色,黄色,绿色,橙色和红色荧光。本文报告了增强纳米灯的各种应用,包括监测多种细胞事件,例如亚细胞结构和基因表达的动态。您必须看到演示CA的电影2 +动力学在心肌细胞。

增强的纳米灯构建体可通过addgene:绿松石(CEN1;质粒#85199.)、黄(YeNL;质粒#85201),橙色(Oenl; polasmid#85202)和红色(Reng; polasmid#85203) NLuc融合。的Nagai实验室已另外沉积超过25个增强纳米灯的融合到其他细胞蛋白。

利用Nanoluc®Luciferase的布雷特的生物传感器

许多像钙释放这样的细胞内传感器已经通过荧光共振能量转移(烦恼探针。这些探针通常由融合到两个荧光蛋白的响应蛋白(例如钙结合蛋白)组成。伟德2021足球欧洲杯买球平台当响应蛋白结合钙时,它会改变构象并将两个荧光蛋白聚集在一起,从而增加它们的褶皱信号。伟德2021足球欧洲杯买球平台FRET是从一个荧光蛋白到相容的荧光蛋白的非辐射能量转移。可以通过激发最蓝色偏移的荧光蛋白(供体)并测量该对中的红移荧光蛋白(受体)的所得发射来测量。来自受体的排放越高,FRET信号越强大。在设计精心设计的基于FRET的生物传感器中,FRET信号的强度可以与特定的生物分子浓度相关。

FRET传感器面临着光漂白、自身荧光以及光毒性等挑战。使用FRET传感器的另一个挑战是使用光基因调控器来启动被监测的事件。光基因调控因子对特定波长的光作出反应,从而启动信号。当FRET供体激发波长与光遗传起始波长重叠时,光遗传调节器的激发会导致FRET传感器的杂散激活。

研究人员试图通过将荧光供体交换为生物荧光供体,制造BRET探针来缓解这些挑战。在这里,生物荧光供体不受其他荧光探针激活的影响,但仍然可以转移能量到荧光蛋白受体。NLuc具有明亮的发光特性,是一种优良的BRET供体。

细胞内钙离子传感器

杨等人(7)希望用致敏受体,黑色素释放细胞内Ca ++释放,使短暂暴露于470nm的蓝光。为避免重叠与该光源工具,他们需要创建具有以下特征的钙传感器:

  • 没有相磷
  • 高离子特异性
  • 高灵敏度
  • 轻松表达
  • 提供比例数据

结果是一种叫做CalFlux VNT的融合蛋白。CalFlux VNT由Venus荧光蛋白、肌钙蛋白cca ++结合域和NanoLuc®荧光素酶组成。CalFlux VNT可对细胞内钙的变化做出反应,并可用于细胞和脑外植体事件的直接成像。该构建体可通过addgene(质粒#83926)。

细胞内钙离子传感器

Live-Cell电压传感器

Ingaki和同事(8)感兴趣的是使用光激活的、光遗传的定位器去极化或超极化膜。传统的FRET报告不能使用,因为所需的激发波长也会激活光遗传校正器。研究人员使用NanoLuc®荧光素酶将一个FRET报告基因转化为BRET报告基因,通过与膜插入的电压感应域(LOTUS V;通用感应电压的发光光学工具)。使用该传感器,膜去极化增加BRET信号,而超极化降低信号。作者还证明了LOTUS V在许多模型系统中都可以工作。该构建体可通过addgene(质粒#87127)

将NanoLuc®荧光素酶与荧光蛋白配对,使得研究人员能够制造其他伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光素酶无法实现的创新工具。在这些工具中,nanoluc -荧光蛋白融合使NLuc的亮蓝色发光波长对细胞和在活的有机体内成像。Nluc additonally允许研究人员将FRET生物传感器转化为更通用的布雷特生物传感器,甚至可以与光学调节器配对。许多这些工具可从Addgene获得,我们很高兴看到您在您的小组中使用它们!


非常感谢我们的客座博主Kyle Hooper。

凯尔Hooper头像前技术服务科学家凯尔盖勒博士博士还与产品开发的研发合作,现在专门支持Promega的Promega细胞分析产品。

参考

1.大厅,一下。et al。(2012)利用一种新型咪唑吡嗪酮底物从深海虾中工程荧光素酶报告。ACS Chem Biol.7,1848-57。PubMedPMID:22894855。公共医学中心PMCID: PMC3501149

2.施密德,学生论文et al。CRISPaint允许使用连接酶-4依赖的机制进行模块化碱基特异性基因标记。自然通讯。7, 12338年。PubMedPMID:27465542。公共医学中心PMCID:PMC4974478

3.肖布,F.Xet al。(2015) fluorophos - nanoluc BRET报告基因使敏感的体内光学成像和流式细胞术监测肿瘤发生。癌症res。75, 5023 - 33所示。PubMedPMID: 26424696。公共医学中心PMCID: PMC4668208

4.楚,J。。(2016)一种明亮的蓝色可兴奋橙色荧光蛋白促进双发射显微镜和增强生物发光成像。生物科技本质》34760-7。PubMedPMID:27240196。公共医学中心PMCID: PMC4942401

5.Susuki, K。et al。(2016)五种颜色的明亮发光蛋白实时多色生物成像。自然环境7,13718. PUBMED.PMID:27966527。公共医学中心PMCID:PMC5171807

6. Machleidt,T.,et al。(2015)纳米多元 - 一种用于分析蛋白质 - 蛋白质相互作用的新型布雷特平台。ACS化学。医学杂志。10,1797-804。PubMedPMID:26006698

7.扬,J.,et al。(2016)耦合光遗传刺激与NanoLuc-based luminescence (BRET) Ca++传感。自然通讯。7,13268. PubMed.PMID:27786307。公共医学中心PMCID:PMC5476805.

8.Inagaki、S。et al。(2017)基因编码生物发光电压指示器用于广泛的生物成像。举报7, 42398年。PubMedPMID: 28205521。公共医学中心PMCID:PMC5322354

addgene博客上的其他资源伟德体育中心

更多资源请访问Addgene.org

主题:伟德2021足球欧洲杯买球平台,烦恼

发表评论

分享科学变得更容易了……订阅我们的博客

订阅