Tetbow:用于神经元追踪的明亮多色标记

客人的博客

本文由京都大学的Richi Sakaguchi、九州大学的Marcus N. Leiwe和Takeshi Imai共同撰写。

随机多色标记是一种有效的神经元识别方法,可用于基于光显微镜的神经元重建。实现随机多色标记,大脑彩虹使用了Cre-loxP系统在转基因中表达三个荧光蛋白(XFP)基因中的一个。当转基因盒有多个拷贝时,随机性会导致这三个拷贝数不同的基因组合表达,产生数十种颜色(Livet等人,2007;Cai等人,2013)。然而,“彩虹”的亮度本来就很低。这是因为荧光蛋白的随机和组合表达只能在低拷贝数范围内进行,从而导致低荧光蛋白水平。伟德2021足球欧洲杯买球平台

Tetbow的原理

在现代神经科学中,质粒或病毒载体介导的基因传递比传统的转基因策略更为常见。在这种基于载体的基因传递系统中,只要简单地引入XFP基因的混合物,就可以实现XFP的随机表达。当每一个XFP基因以每个细胞每个颜色~2个拷贝的方式被引入时,随机多色标记是可能的,遵循泊松分布。为了克服原始方法中有限的XFPs表达水平,我们使用四环素trans-activator系统提高表达水平,我们将系统命名为Tetbow(春节racycline trans-activator大脑)(Sakaguchi等人,2018)(图1)。一旦引入,用SeeDB2清除组织后,荧光蛋白的成像伟德2021足球欧洲杯买球平台效果最好(Ke等人,2016, 2018)。

多色标签tetbow

如何使用Tetbow进行神经元标记

要使用Tetbow,你可以引入四个Tetbow质粒(添加基因#104102 - #104105)使用在子宫内我们也创建了包含化学标签的结构,如SNAP-tag, Halo-tag和CLIP-tag(图2)。Kohl等人,2014(Addgene #104106 - #104108)(图3)可以使用在子宫内电穿孔。然后在你喜欢的时间点,牺牲动物并固定样本。当您使用aav时,通常需要几个星期才能实现XFPs的最佳表达。再长一点,细胞可能会因为过量的XFPs表达而开始出现形态异常。然后,清除样本,形象化。

有关此过程的详细信息,请查找协议在这里

多色标签使用tetbow

使用tetbow进行化学标记

提示和排除你的Tetbow实验

  1. 质粒浓度和AAV效价- XFP基因必须在每个细胞每个颜色引入~2个拷贝,以获得最高的颜色变异。调整质粒浓度或AAV滴度以获得最佳效果。
  2. 使用Tetbow aav时牺牲的时机你需要等几个星期才能达到Tetbow aav的适当表达水平。但是,您不应该等待太长时间,因为过多的XFP对细胞是有毒的。
  3. XFPs表达水平不足减少tTA的数量矛盾的是,过多的tTA会导致XFPs表达水平的降低,很可能是通过抑制转录。表达少量的tTA是达到最高表达水平的关键。
  4. 清理大型组织-荧伟德2021足球欧洲杯买球平台光蛋白在SeeDB2中非常稳定。然而,对于大的大脑样本来说,SeeDB2的功能还不够强大。对于大的大脑样本,我们建议使用ScaleCUBIC1 (Susaki等人,2014),然后与SeeDB2结算。

欲了解更多信息,请访问我们的SeeDB资源网站。我们定期更新网站,希望Tetbow可以在你的研究中帮助你。

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想要了解Tetbow的行动,请看下面描述d二尖瓣细胞的末端布线。


非常感谢我们的客座博主Richi坂口的来自京都大学的Marcus N. Leiwe和Takeshi Imai九州大学。

RichiRichi Sakaguchi是京都大学的一名研究生。他对开发用于追踪神经回路的基因工具感兴趣。

马库斯Marcus Leiwe是九州大学的助理教授。他对感官系统的发展特别感兴趣,主要研究嗅觉系统的功能和解剖成熟。

武今井武(Takeshi Imai)是九州大学的教授。他的实验室一直在利用光学显微镜研究感觉回路发展的功能和解剖学方面。实验室网站:https://dn-en.med.kyushu-u.ac.jp/

参考文献

蔡达文等。"改进了Brainbow工具箱的工具"自然方法10.6(2013): 540。PubMedPMID: 23817127。公共医学中心PMCID: PMC3713494

柯孟聪等。"神经元回路的超分辨率映射与指数优化的清算剂"细胞的报道14.11(2016): 2718 - 2732。PubMedPMID: 26972009

Ke, Meng-Tsen和Takeshi Imai。使用SeeDB2对组织样本进行高分辨率荧光成像的光学清晰度和指数匹配Bio-Protocol8 (2018): e3046。

Livet, Jean等人。神经系统中荧光蛋白组合表达的转基因策略伟德2021足球欧洲杯买球平台自然450.7166(2007): 56。PubMedPMID: 17972876

Kohl, Johannes等。“用化学标记进行组织超快速染色。”美国国家科学院院刊111.36 (2014): E3805-E3814。PubMedPMID: 25157152。公共医学中心PMCID: PMC4246963

Sakaguchi, Richi, Marcus N. Leiwe和Takeshi Imai。“用荧光蛋白和化学标签标记神经元回路的明亮多色标记”eLife 7 (2018): e40350。伟德2021足球欧洲杯买球平台PubMedPMID: 30454553。公共医学中心PMCID: PMC6245733

Susaki, Etsuo A.等“全脑成像与单细胞分辨率使用化学鸡尾酒和计算分析。”细胞157.3(2014): 726 - 739。PubMedPMID: 24746791

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