你从Addgene中得到了编码你想要的蛋白质的质粒，把它转染到你的目标细胞中，现在怎么办?你如何知道你如此热衷研究的蛋白质是否在你的细胞中表达?免疫印迹法(Immunoblotting，简称western blot)是检测蛋白质是否存在的最简单的方法之一(Renart等人，1979年,托宾等人，1979年,Burnett等人，1981年)。
western blotting的介绍
在西方，蛋白质是:
(1)按大小分开，
(2)转移到膜上，和
(3)检测使用抗体。
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| 图1:Western blot过程概述。从蛋白质混合物开始，它在凝胶中分离，转移到膜上，用抗体染色，并显示出来。 |
这个过程允许你在细胞或组织的复杂混合物中检测一个单一的，特定的蛋白质。蛋白质不仅可以用来检测蛋白质的存在或缺失，还可以确定蛋白质在系统中是上调还是下调，检测翻译后修饰，量化相对于标准的蛋白质水平，检测蛋白质的细胞位置，并可作为蛋白质相互作用研究的读数，如免疫沉淀和下拉分析。
西部片分为两类，天然的和变性的。在一个本地西方，蛋白质的二级和三级结构保持完整，蛋白质通过基质通过电荷分离。在一个变性的西方，蛋白质变性到它的一级结构，并按大小分开，较小的分子在基质中移动得更快。在这篇博客中，我们主要关注改变西部片的性质。
按大小分开蛋白质混合物
十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是西方的第一步。为了制备SDS-PAGE的样品，测量蛋白质含量并使常规化以确保等效的负载。通过沸腾在通常含有硫醇的还原剂的存在下使它们对其主要氨基酸序列的样品变性，以裂解二硫键。将样品，每泳道一个样品，在分离凝胶的顶部上，由交联聚合物丙烯酰胺组成。除了样品之外，单独车道中已知分子量的蛋白质标准可以帮助确认感兴趣的蛋白质的尺寸。施加到凝胶的电流使带负电荷的蛋白质朝向凝胶底部的正电荷迁移并分开尺寸。
较小的蛋白质在丙烯酰胺基质中遇到的阻力较小，并且在凝胶中迁移得更快。为了更好地分离蛋白质，改变凝胶中丙烯酰胺的含量。对于小的蛋白质，使用较高比例的丙烯酰胺来增加迁移阻力和改善分离。对于大的蛋白质，减少丙烯酰胺的百分比。
为了进一步提高分辨率，在解析凝胶上使用堆叠凝胶。堆叠凝胶通常具有不同的离子强度，pH值和丙烯酰胺含量比分解凝胶低。在这些条件下，样本中的所有蛋白质以相同的速度通过堆叠凝胶迁移，并同时进入分解凝胶，然后按大小将它们分离。梯度凝胶是另一个提高分辨率的好选择。在这种方法中，从上到下，凝胶中丙烯酰胺的含量范围越来越大，允许在单一凝胶中分离出大尺寸范围的蛋白质混合物。
固定在膜上的蛋白质
一旦分离，蛋白质被固定在膜上，通常由硝化纤维或聚偏二氟乙烯(PVDF)组成，这一步称为蛋白质转移。虽然硝基纤维和PVDF都是常用的材料，但由于其耐用性和高结合力，PVDF更受欢迎。此外，PVDF膜可以反复剥离一种抗体，并使用不同的抗体进行排斥，从而可以从单一western中评估多个目标。
有几种不同的蛋白质转移步骤包括湿法、半干,干但都遵循相同的一般原则,凝胶和膜“夹”在一起用吸墨纸和电流应用导致蛋白质的凝胶迁移和附着在膜。
在一个湿传输系统三明治完全浸没在填充有配制的转移缓冲器的罐中以进行电流。湿转移过程在转移广泛的蛋白质尺寸时非常有效，但需要几小时待过夜。
相比之下，一个半干转移只需要足够的缓冲液来饱和三明治，通常需要不到一个小时的时间。然而，使用这种方法大的蛋白质通常不能很好地转移。
最后,商用印迹干燥系统在没有任何转移缓冲液的情况下有效地在几分钟内转移一系列蛋白质尺寸。然而，这些系统要求您购买昂贵的系统特定的三明治。
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| 图2:western blot干燥仪包括一堆滤纸、一铜阳极/印迹凝胶基质、印迹膜、凝胶、一铜阴极/印迹凝胶基质和滤纸。很像真正的三明治!S ' mores图像从埃文·阿莫斯。 |
转移后，膜的一些区域仍然没有被蛋白质结合。这些未结合的区域是“粘性的”，有可能与用于染色的抗体非特异性结合。为了解决这个问题，膜在染色前在含有脱脂牛奶、牛血清白蛋白或其他蛋白质的缓冲液中孵育。细胞膜上的粘性区域会与缓冲液中的蛋白质结合，在染色过程中阻止细胞膜与抗体的结合。理想的阻断缓冲取决于所使用的抗体和标记，可能需要一些试验和错误(Yang et al.， 2012)。
选择一种抗体
一旦膜被堵塞，它就会被一种针对你感兴趣的蛋白质的一种抗体染色。但是你应该使用哪种抗体呢?你可能会从不同的供应商那里找到针对你感兴趣的蛋白质的几种不同的抗体选择，你甚至可能会发现编码来自addgene的抗体的质粒你可以自己做。
要缩小搜索范围，首先要注意供应商网站上列出的已验证的应用程序，并选择一种已经过免疫印迹验证的抗体。不同的免疫检测方法检测不同状态的蛋白质。例如，在免疫沉淀(IP)中，抗体在其固有状态下与蛋白质相互作用，而western blot检测变性多肽链。可用于抗体结合的蛋白质区域，或表位，在蛋白质的自然状态和多肽链之间是不同的。因此，经过IP验证的抗体可能对西方人不起作用，反之亦然。
除了已验证的应用程序，请密切关注供应商网站上列出的控制。通常情况下，供应商会证明他们的抗体能与正确大小的蛋白质结合。许多供应商将证明该抗体与短暂过表达的蛋白结合，然而，他们也应该证明该抗体在生理相关水平上有效地与内源性表达的蛋白结合。一些供应商还将在各种组织中测试他们的抗体，以证明蛋白质染色符合预期的组织表达模式。最近，敲除或敲除系已成为抗体验证的金标准。这种级别的验证确保抗体对预定目标染色。
一旦选择抗体，彻底读取数据表。供应商经常包括用于工作浓度，阻塞缓冲液和孵化时间的建议。如果供应商包括引用抗体的出版物，请考虑审查这些出版物的材料和方法。
最后，一定要验证所选择的抗体在你特定的实验环境中起作用(Pillai-Kastoori等人，2019)。供应商用于验证的组织或细胞系可能含有非预期的交叉反应蛋白。类似地，如果您改变了供应商使用的实验条件，那么可能会导致非特异性绑定。
只要可能，包括积极和消极的控制。阳性对照通常包括已知在生理相关水平表达该蛋白的细胞系或组织(不是过表达系统)，而阴性对照是那些不自然表达该蛋白或基因表达被敲除或敲除的细胞。如果您有兴趣制作您自己的敲除行进行验证，请查看本教程斯图尔特·奥尔金和丹尼尔·鲍尔的实验室
在二级抗体的帮助下，观察你想要的蛋白质
为了看到细胞膜上的蛋白质，抗体通常与一种酶结合，如辣根过氧化物酶(HRP)，该酶与特定底物反应时会发光。发出的光，或化学发光，在x射线胶片上或用特定的成像设备检测。在大多数情况下，结合目标蛋白的一抗是不被标记的。相反，一种偶联的种特异性二抗被用来可视化蛋白质。在这种设置中，多个二抗分子结合一抗并放大检测信号。
western blot分析
一旦发现，是时候分析你感兴趣的蛋白质了。分析通常从确认与蛋白质标准相比较的蛋白质的预期大小开始。
蛋白质的丰度
此外，条带的厚度提供了关于样品中蛋白质的相对丰度的信息。蛋白质越多，条带越厚，而蛋白质越少，条带越薄。然而，需要注意的是，在评估蛋白质丰度或横向比较样本时，必须包含一个加载控制。
对于一个典型的负载控制膜探针与抗体检测无处不表达的蛋白质，如肌动蛋白。在凝胶上的所有样品中肌动蛋白的水平应该是一致的，并且在所有样品中都应该被观察为具有一致的大小和密度的条带。不均匀的样品装载或不完全的蛋白质转移导致不一致的装载控制水平。在这些情况下，应该重复西方的做法。
最后，虽然西方人是测量蛋白质丰度的有用方法，但他们提供了定性的测量。如果你需要精确的蛋白质定量，可以考虑使用其他方法，如酶联免疫吸附试验(ELISA) (Aydin等人。，2015年)。
翻译后修改
除了蛋白质丰度外，蛋白质蛋白质还能检测蛋白质翻译后修饰的变化，如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。例如，为了测试蛋白质是否在特定的实验条件下被磷酸化，你可以在治疗前后寻找蛋白质带的轻微大小变化。
对一些细胞分析来说，蛋白质图谱也是一种有用的解读。它们可以确定免疫沉淀后的蛋白质相互作用，是亚细胞分离(从不同的细胞室如线粒体、细胞质和细胞核分离蛋白质的过程)的常见读数。
我们希望这篇博客为您提供了Western Blot的良好概述。在计划西方时，注意包括适当的阳性和阴性对照，选择验证的抗体，并在特定系统中测试抗体。如果您发现此博客有用务必务必退房Addgene的博客有关其他抗体主题的概览。
资源和引用
参考
Aydin S(2015)简要介绍了ELISA的历史、原理和类型，以及我们使用ELISA进行肽/蛋白分析的实验室经验。肽72:4-15。https://doi.org/10.1016/j.peptides.2015.04.012
Burnette WN(1981)“Western Blotting”:电泳将蛋白质从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶转移到未修饰的硝化纤维素，并用抗体和放射性蛋白a进行射线检测。分析生物化学112:195-203。https://doi.org/10.1016/0003 - 2697 (81) 90281 - 5
Pillai-Kastoori L, Heaton S, Shiflett SD, Roberts AC, Solache A, Schutz-Geschwender AR(2019)免疫印迹抗体验证:由用户，为用户。生物化学杂志295:926-939。https://doi.org/10.1074/jbc.ra119.010472
Renart J, Reiser J, Stark GR(1979)蛋白质从凝胶转移到重氮苄酶羟甲基纸和抗血清检测:一种研究抗体特异性和抗原结构的方法。美国国家科学院学报76:3116-3120。https://doi.org/10.1073/pnas.76.7.3116
蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶到硝基纤维素薄片的电泳转移:程序和一些应用。国家科学院学报76:4350-4354。https://doi.org/10.1073/pnas.76.9.4350
杨鹏程(2012)免疫印迹技术的研究与应用。North Am J Med Sci 4:429。https://doi.org/10.4103/1947-2714.100998
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