Aptamer汤中的荧光蔬菜

由Aliyah Weinstein.

如果你一直在跟踪的话Addgene上#souptwitter或者,如果您在冬日享用温暖的饭,您应该乐意了解许多基于DNA的试剂被命名为汤成分!从pSOUPmCherry,令人满意成分试剂渗透分子生物学家厨房实验室和使用适配体的科学家可能最清楚这一点,因为大多数荧光适配体都是以水果或蔬菜命名的!

什么是RNA适配体?

适体荧光团绑定

RNA本身不是荧光的,追踪细胞内具有挑战性,但核酸适配体允许研究细胞内RNA动力学。核酸适配体是10-100个碱基的核酸寡核苷酸,与小分子具有高亲和力,诱导它们发出荧光。在结合事件发生之前,适配体和小分子都不具有强荧光,但是适配体与目标小分子的结合激活了小分子的荧光。荧光RNA适配体用于追踪细胞过程通过将细胞与编码适体标记的RNA的质粒转化,后来将小分子引入细胞中。产生的荧光允许通过将具有适体和RNA转录标记通过将可知启动子下游的适体和RNA转录标记RNA序列来定性和定量测量。

Addgene的质粒101:适体荧光团描述用于评价寡核苷酸与特定目标结合亲和力的富集过程,以及使适体生物学成为强大工具的分子过程。在这篇文章中,我们将通过探索Addgene收集中的荧光RNA适配体的开发和应用,更深入地了解Addgene适配体汤的内容。

标记的RNA荧光Aptamer绿色荧光适体

菠菜和西兰花及其衍生物是能够与绿色荧光蛋白的小分子衍生物3,5-二氟-4-羟基苄基咪唑啉酮(DFHBI)结合的合适体。DFHBI具有膜通透性,对细胞无毒。由于DFHBI可快速光漂白,因此只能用于定性研究,不能用于定量研究。此外,菠菜,第一个被鉴定为与DFHBI结合的适体,是高度不稳定的在活的有机体内由于在37°C时折叠不良和热不稳定性(Ouellet等人,2016),需要tRNA支架来提高其稳定性在活的有机体内

然而,菠菜已经被证明是有用的工程riboswitches。核糖开关是mRNA 5 ' UTR中自然发生的区域,它与代谢物结合,导致控制编码RNA表达的构象变化。基于菠菜的Riboswitches可作为稳定的代谢物传感器用于活细胞成像。通过将菠菜置于核糖开关的下游,代谢物与核糖开关结合反而激活菠菜的荧光。

为了寻找更稳定的定量成像,Ming Hammond的团队创建了菠菜使用定点诱变的菠菜。在此过程中,他们鉴定出了导致菠菜不稳定的核苷酸,并能够开发出一种更热稳定的适体,表现出更少的错误折叠,因此比菠菜更明亮。

使用菠菜的初始研究表明它在脆弱-X震颤/共济失调综合征的模型中跟踪RNA动态的能力(Strack等人,2013)。从那时起,Spinach2已被用于研究神经元细胞内病毒DNA动力学(Nilaratanakul等人,2017)和革兰氏阳性细菌的第二信使环二磷酸腺苷(Kellenberger等人,2013)。荧光团发射光谱

菠菜的其他变种包括菠菜,一种迷你菠菜,当与DFHBI结合时,它保留了类似的荧光水平,尽管它的长度大约是DFHBI的一半(Warner等人,2014);它的长度减少了活细胞成像过程中的伪影。一束嫩菠菜即BoBS,含有连续重复的婴儿菠菜。它是在一项研究中发展出来的人造指南RNA.它可以用Cas9同时将细胞RNA定位到细胞内的特定位置,并跟踪复合物的定位。

通过定向的演化鉴定了西兰花,其他绿色荧光素质素。首先,使用指数富集(SELEX)使用配体的系统演化来鉴定激活DFHBI荧光的RNA池。在4-6轮SELEX之后,将RNA池克隆到细菌表达载体中以产生文库。转化细菌,然后在DFHBI存在下通过荧光激活的细胞分选(FACS)分选,以鉴定能够诱导最亮荧光的适体(Filonov等人,2014)。

西兰花与DFHBI结合后的色泽是菠菜的两倍。它也比任何形式的菠菜都要小——长度只有49个核苷酸——由于对镁的依赖性更低,热稳定性更高,因此能够更好地在细胞内保持荧光,使其成为一种潜在的更有用的工具在活的有机体内研究。二聚反应使西兰花的荧光增加约1.8倍,可能是比单体更好的成像选择。花椰菜已经发展成一种拆分适体可用于研究RNA组装。分离适体由“顶部”和“底部”部分组成,每个部分融合到单独的RNA上。当这些RNAs复合物和整个适体可以杂交和折叠时,观察到荧光。(Alam等人,2017)。broccoli-spinach-aptamers

黄色荧光寡核苷酸适配子

就像蔬菜有各种各样的颜色一样,适体也是如此!玉米最近于2017年被描述(Song等人。,2017年)。玉米自然二胺,该二聚体激活3,5-二氟-4-羟基苄基亚咪唑啉酮-2-肟(DFHO)的荧光,从DSRED改性的荧光团。DFHO与DFHBI分享许多结构性,但其结构允许与其RNA适体更大接触。这种增加的玉米和其小分子之间的相互作用使玉米比菠菜和西兰花更有光稳定性,并且可用于定量研究。具体来说,玉米了通过RNA聚合酶III量化RNA转录。通过在唯一地通过RNA聚合酶III(5S,TRNA和U6)唯一转录的转录器的玉米下表达玉米并通过流式细胞术测量玉米荧光,仲裁组能够量化MTOR抑制对RNA聚合酶III活性的影响。

红色和橙色荧光适体

玉米在同一研究中被描述为红色西兰花和橙色西兰花,另外两个适体结合DFHO和荧光分别在红色和橙色通道。红色花椰菜和橙色花椰菜都来源于花椰菜,尽管结合的小分子不同,但它们与花椰菜有相似的特性。值得注意的是,像西兰花一样,红色西兰花和橙色西兰花是不具有光稳定性的,并在研究中提出支持玉米- dfho复合物的光稳定性的唯一性。

对于甜点(最后但并非最不重要的),唯一的水果-命名的适体,芒果,结合噻唑橙(to)的多个衍生物,并发出橙色或红色的荧光,这取决于to衍生物的结构(Dolgosheina等人,2014)。虽然有10种TO的衍生物,芒果最常与to1 -生物素或to3 -生物素一起使用(添加生物素可以使用这个标签从细胞中纯化特定的RNA, to1 -生物素和to3 -生物素都包含乙酸修饰,减少了约7x与RNA的非特异性结合)。芒果发出的荧光几乎和菠菜一样明亮,但与同源小分子的结合具有更高的亲和力。芒果最初被证明是有效的成像单分子和活细胞成像Celegans.。其他的研究小组已经使用芒果来研究rna -蛋白质复合物(Panchapakesan等人,2017)短的非编码RNA(Autour等,2018年)。然后通过微流体辅助鉴定出芒果,造成的芒果II,III和IV的三种变体体外对to1 -生物素的高结合亲和力。与芒果相比,其中两种变体显示出更高的亮度,而且都是光稳定的,对于活细胞和固定细胞成像都很有用。

适配体汤中的新成分

除了这些已经建立的RNA适配体荧光团,还有更多正在开发中,包括来自开发玉米的实验室的胡萝卜和萝卜。使用非自然核苷酸的适配体也正在开发中,这可以帮助适配体更好地结合它们的目标分子。随着工具越来越多,科学进步的可能性也越来越大,在一个像RNA生物学一样具有巨大增长潜力的领域,我们期待着关于适配体汤的下一个补充的报告!

Aptamer Soup博客图片


参考文献

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斯特拉克,丽塔·L,马修·d·迪斯尼和萨米·r·杰弗瑞。“超折叠Spinach2揭示了含有三核苷酸重复序列的RNA的动态特性。”自然方法10.12(2013): 1219。PubMedPMID:24162923。公共医学中心PMCID:PMC3852148

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