高滴度对AAV转导的重要性

由卢克·汉利

卢克·哈利

我们中的许多人在这一事实中享有舒适,但它通常不是数量,但质量真的很重要。好吧,事实证明,使用AAV并非如此。当涉及感染细胞时,滴度,使用的病毒量真的很重要。(* PSST *,质量肯定也很重要)。

查看这篇文章来复习一下AAV的滴度

与细胞接触

虽然个体AAV粒子感染细胞的能力取决于其衣壳结构和它感染的细胞,使这些颗粒感染细胞也非常棘手依赖性。为了使AAV颗粒感染细胞,必须与该细胞进行身体接触。由于每个单元上存在有限量的表面积,因此获得更多AAV与电池接触的方式是增加AAV浓度。

在这个流程图中,你可以看到AAV粒子的比例在减少,它们通过细胞的每个部分进入细胞核,在那里它们的基因可以被表达。

AAV感染流程图

底线是很多AAV颗粒需要将一些好的颗粒进入细胞以产生表达。滴度越高,越好。

AAV运输和转基因表达

AAV感染依赖于滴度很明显,我们需要高滴度,因为细胞和任何AAV颗粒之间的接触都是罕见的。但是仅仅进入细胞并不总是足够的,因此需要更高的滴度。例如,逆行AAV被传送到细胞的轴突。虽然尚未完全理解这种功能的机制,但我们可以想象这种运输可能不是效率100%。因此,已经进入电池的少数AaV颗粒现在必须通过电池向轴轴行进,并且可能散布在甚至更大的区域上,因此需要更高的逆行AAV滴度以成功转导。

在另一个例子中,顺行性AAV的神经元基因表达随着滴度的降低而急剧下降。如图2所示,5x10的表达式11滴度基本上不存在,因为没有足够的病毒产生任何可观察到的表达。滴度加倍到1012在大约200个细胞中表达。滴度增加到1013导致了大约6倍的表达增加[3,图2]。注意表达是如何随着滴度的增加呈指数增长的。这意味着,一旦每个细胞的病毒颗粒低于某个(非常高的)阈值,就可能无法在靶细胞中检测到aav介导的基因表达。

实践考虑因素

如果你有高质量的AAV,你可以通过浓缩你的病毒来解决低滴度的问题。看到我们的集中AAV协议(第10步)来获取如何做到这一点的说明。浓缩病毒可以使您在仍然使用与您的实验设置兼容的体积的情况下,向溶液中添加更多的病毒粒子。

一些实验需要更高的基因表达,因此比其他实验滴度更高。高滴度通常是可视化荧光蛋白表达的必要条件,例如,许多病毒颗粒必须感染细胞才能实现蛋白质的可见表达。伟德2021足球欧洲杯买球平台然而,在你的实验中,受体的表达可能不需要那么高才能获得可观察到的信号,因此,当使用AAV构建受体时,滴度可能不需要那么高。在通道视紫红素的情况下,与获得良好荧光信号所需的荧光蛋白相比,被转导的细胞变得对光敏感所需的通道蛋白较少。伟德2021足球欧洲杯买球平台当寻找有效的基因表达时,可能没有必要将这种类型的载体浓缩到如此高滴度。

首先如何达到高滴度?

已知一些AAV难以在高滴度中产生。这些包括AAV2,已知将其粘附到细胞内部,导致较少的颗粒释放到悬浮液中并降低可以从周围介质收获的病毒颗粒的数量。

尽管如此,您可以通过各种方式优化AAV生产。我们列出了一些简单的步骤,您可以在下面采取,但您应该阅读我们的AAV生产协议获取其他最佳实践。

  • 让您的细胞快乐 - 确保您的细胞尽可能健康,以便为产生病毒颗粒的艰巨过程来制备它们。
  • 限制管转移 - 您的病毒颗粒必须粘在管的机会越少,您将拥有的较高滴度。当可能时,使用低绑定或硅化管来存储样品,因为病毒颗粒更难以粘附在这些管中。
  • 冲洗过滤器 - 使用浓度过滤器柱时,请务必用周围溶液冲洗滤膜的表面,以确保过量的病毒颗粒不保持粘附到膜上。
  • 稀释的时候要小心——如果你的AAV浓度超过了你想要的滴度,想要稀释它,在加入缓冲液时要小心。加的缓冲液比你想要的少一点,以达到准确的期望浓度,避免过度稀释,并确保稀释后重新测量滴度来确定。

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卢克·哈利卢克·马卡纳·汉利(Luke Makana Hanley)是Addgene的研究团队实验室技术人员,致力于改进AAV的生产方法。

参考

1.克拉克,k·里德。重组腺相关病毒载体生产的最新进展肾中国际61.1 (2002): S9-S15。PubMedPMID:11841606

2. Schultz Br,张伯伦js。重组腺相关病毒转导和整合。分子疗法:美国基因治疗学会杂志。2008; 16(7):1189-1199。DOI:10.1038 / MT.2008.103。PubMedPMID:18500252。公共医学中心PMCID:PMC2574934

3.Zingg,Brian等。“AAV介导的前突触突触标记:映射皮质胶质胶凝输入定义的神经途径,用于防御行为。”神经元93.1(2017): 33-47。PubMedPMID: 27989459。公共医学中心PMCID:PMC5538794

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