PAM要求和扩展SPCAS9之外的CRISPR

由Joel McDade.

最初发布于2015年11月12日,最后更新了20月20日,2020年8月20日。

CAS9可用于修饰任何所需的基因组靶标,条件是(1)序列与基因组的其余部分相比是独一无二的,并且(2)序列位于相邻基序(PAM序列)的原子晶仪的上游。3-5个核苷酸PAM序列用作CAS9的结合信号,该序列是Cas9介导的DNA切割的严格要求。

CAS9具有不同PAM要求的变体可用于定位不同的基因座

需要更多PAM序列

而Pam序列为常用的序列S. pyogenesCas9(3'-ngg)在整个人类基因组中丰富,它们并不总是正确定位以靶向特定基因。此外,靶序列可以在基因组中的其他地方具有高同源性。这些脱靶序列可以无意中突变以及所需的目标基因座。

当尝试编辑基因时,PAM序列特别关注使用同源性定向修复, 自从HDR介导的基因编辑是最有效的当目标站点位于要编辑的区域附近时。在这个博客文章中,我们将涵盖三种方法来规避这一限制:1)使用小说S. pyogenesCas9变异,具有不同的PAM序列,2)使用Cas9同源物源自除外的物种S. pyogenes3)使用非CAS9酶。

(有关PAM网站的更多详细信息,请从IGI查看此视频!)

合成的S. pyogenesCas9s具有新的PAM识别

2015年,Keith Joung的实验室在细菌中进行了一系列阳性选择屏幕以识别突变体S. pyogenesCas9能够切割位于NGA或NGC PAM序列的上游的靶DNA序列(Kleinstiver等,2015)。从这些屏幕中,它们确定了四种新的SPCAS9变体,改变了PAM结合特异性:

SPCAS9变体

突变(相对于SPCAS9)

PAM序列

D1135E变体

D1135E.

n

VQR Variant.

D1135.V.,R1335问:和T1337.R.

ngan或ngng.

EQR Variant.

D1135.E.,R1335问:和T1337.R.

NGAG.

VRER VARIANT.

D1135.V.,G1218R.,R1335E.和T1337.R.

NGCG.

D1135E变体是对此有些选择性典范S. pyogenesPAM序列与野生型SPCAM相比,这也显示出一些带有NGA PAM的裂缝。当使用时,该变体可以增加与NGG PAM序列相邻的DNA靶标在邻近野生型SPCAS9时的基因组修饰的特异性。剩余的变体(VQR,EQR和VRER)识别新型PAM序列(如上所示)。VQR,EQR和VRER CAS9变体能够在哺乳动物细胞和斑马鱼胚胎中切割基因组DNA,并且它们可用于修饰不能使用野生型SPCAS9进行修饰的基因组基因座。VQR和VRER变体的脱靶切割事件的数量类似于野生型SPCAS9,表明该变体可能就像野生型SPCAS9一样选择性。这些VQR,EQR和VRER SPCAS9变体有效地使人类基因组内的CRISPR / CAS9的靶向范围加倍。

另一个变种,XCAS9 3.7具有在REC2,REC3和PAM相互作用域中发现的7个突变并且允许扩展的PAM识别以及增加的特异性和降低目标活动(Hu等,2018)。

2020年,Kleinstiver实验室报告了近乎Pamless Cas9变体的开发。这些变种,命名spg和spry.,可以瞄准ngn pams和nrn和nyn pams分别(Walton等,2020)。

来自额外细菌种类的Cas9的表征

许多Cas9 Orthologs已被隔离,我们对其PAM的理解如下表所示。

Cas9物种

PAM序列')

链球菌Pyogenes(SP)

3'ngg.

金黄色葡萄球菌(SA)

ngrrt或ngrrn.

Neisseria Meningitidis(NM或NME)

nnngatt.

Campylobacter Jejuni(CJ)

nnnnryac.

链球菌嗜热菌(ST)

纳戈爪

Treponema Denticola(TD)

naaaac.

〜20种额外的Cas9种类

PAM序列可能无法表征

非SPCAS9的绑定各种PAM序列,这使得它们在没有适当的SPCAS9 PAM序列时有用。此外,非SPCAS9可能具有其他特征,使它们比SPCAS9更有用。例如,来自金黄色葡萄球菌(SacAs9)的Cas9约为小于SPCAS9的1千碱基,因此可以是包装成腺相关病毒(AAV)

在984个氨基酸的长度,Cas9来自Campylobacter Jejuni.(CJCAS9)甚至比Saca9小,也与AAV交付兼容。nmcas9.,另一个小ortholog,显示器低于目标编辑而不是野生型SPCAS9,即使在已知使用SPCAS9产生非目标编辑的目标网站(Amrani等,2018)。选择CAS9时,请记住检查您的TRACRRNA和CRRNA(或合成GRNA)来自相同物种。

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扩展CRISPR工具箱

新型克里普尔蛋白的分离有并将继续大大增加CRISPR应用的数量。适用于基因组工程的第一个非CAS9 CRISPR蛋白是CAS12A(以前的CPF1),核酸酶产生靶基因中的双链断裂,导致形成“粘性末端”而不是Cas9产生的钝端。CAS12A显示器低于目标编辑而不是SPCAS9(Kim等,2016)。acidaminococccus sp。BV3L6 CAS12A,ASCPF1使用5'-TTN PAM,使其更容易目标富含富含基因组(Kleinstiver等,2016年)。

VI型CRISPR系统,目标RNA,提供额外的目标灵活性。CAS13A(以前的C2C2)已适用于哺乳动物细胞中的靶向RNA裂解。这修复(RNA编辑用于我更换的可编程A)系统保险Cas13b至RNA deaminase ADAR2以创建特定的RNA编辑器。Cas13酶是有利的,因为它们不需要PAM,并且RNA靶向可能是可逆的,因为没有基因组编辑。一些CAS13酶需要与目标相邻的单个基地原始侧面序列(PFS),但是许多不具有,显示该系统的灵活性。

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注意:Jen云顶娱乐 韦德国际nifer Tsang和Mary Tearing有助于更新这篇文章。

参考

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