PAM需求和扩展CRISPR超越SpCas9

最初发布于2015年11月12日，最后更新了20月20日，2020年8月20日。

CAS9可用于修饰任何所需的基因组靶标，条件是（1）序列与基因组的其余部分相比是独一无二的，并且（2）序列位于相邻基序（PAM序列）的原子晶仪的上游。3-5个核苷酸PAM序列用作CAS9的结合信号，该序列是Cas9介导的DNA切割的严格要求。

需要更多PAM序列

而Pam序列为常用的序列链球菌Cas9（3'-ngg）在整个人类基因组中丰富，它们并不总是正确定位以靶向特定基因。此外，靶序列可以在基因组中的其他地方具有高同源性。这些脱靶序列可以无意中突变以及所需的目标基因座。

PAM序列是特别关注时，试图编辑一个基因使用同源性定向修复,因为hdr介导的基因编辑效率最高当目标站点位于要编辑的区域附近时。在这篇博文中，我们将介绍三种方法来规避这个限制:1)使用novel链球菌Cas9变异与不同的PAM序列，2)使用Cas9同源物从物种以外链球菌3）使用非CAS9酶。

（有关PAM网站的更多详细信息，请从IGI查看此视频！）

合成链球菌Cas9s具有新的PAM识别

2015年，Keith Joung的实验室在细菌中进行了一系列阳性选择屏幕以识别突变体链球菌Cas9能够切割位于NGA或NGC PAM序列的上游的靶DNA序列（Kleinstiver等，2015）。从这些屏幕中，它们确定了四种新的SPCAS9变体，改变了PAM结合特异性：

D1135E变体是更有选择性的规范链球菌PAM序列与野生型SpCas9相比，NGG也表现出一些与NGA PAM的切割。当替代野生型SpCas9时，这种变异可能会增加NGG PAM序列附近DNA靶标的基因组修饰的特异性。剩下的变体(VQR、EQR和VRER)可以识别新的PAM序列(如上所示)。VQR、EQR和VRER Cas9变种能够切割哺乳动物细胞和斑马鱼胚胎中的基因组DNA，它们可以用来修饰野生型SpCas9无法修饰的基因组位点。VQR和VRER变异的脱靶切割事件的数量与野生型SpCas9相似，这表明变异可能和野生型SpCas9一样具有选择性。这些VQR、EQR和VRER SpCas9变体有效地使CRISPR/Cas9在人类基因组中的靶向范围增加了一倍。

另一个变种，XCAS9 3.7具有在REC2、REC3和PAM相互作用域发现7个突变并且允许扩展的PAM识别以及增加的特异性和降低目标活动（Hu等，2018）。

2020年，Kleinstiver实验室报告了近乎Pamless Cas9变体的开发。这些变种，命名抢断和敏捷，可以瞄准NGN PAMs, NRN和NYN PAMs分别（Walton等，2020）。

从其他细菌种类中鉴定Cas9

更多的Cas9同源物已经被分离出来，我们对其PAMs的理解如下表所示。

非SpCas9蛋白结合多种PAM序列，这使得它们在没有合适的SpCas9 PAM序列存在时很有用。此外，非SpCas9可能有其他特性使它们比SpCas9更有用。例如，来自金黄色葡萄球菌的Cas9 (SaCas9)比SpCas9小约1千碱基，所以它可以包装成腺相关病毒(AAV)。

长度为984个氨基酸，Cas9来自空肠弯曲杆菌（CJCAS9）甚至比Saca9小，也与AAV交付兼容。nmcas9.另一个小的同源物显示低于目标编辑而不是野生型SPCAS9(Amrani et al.， 2018)。当选择一个Cas9时，记得检查你的tracrRNA和crRNA(或合成gRNA)来自同一物种。

扩展CRISPR工具箱

新型克里普尔蛋白的分离有并将继续大大增加CRISPR应用的数量。适用于基因组工程的第一个非CAS9 CRISPR蛋白是CAS12A（以前的CPF1），核酸酶在目标基因中产生双链断裂，从而形成“粘性末端”，而不是Cas9创造的钝端。Cas12a显示低于目标编辑而不是SPCAS9(Kim等人，2016)。Acidaminococcus sp. BV3L6 Cas12a, AsCpf1，使用5'-TTN PAM使其更容易目标富含富含基因组（Kleinstiver等，2016年）。

VI型CRISPR系统，目标RNA，提供额外的目标灵活性。Cas13a(原名C2c2)已被用于哺乳动物细胞的靶向RNA裂解。的修复（RNA编辑用于我更换的可编程A）系统保险Cas13b至RNA deaminase ADAR2以创建特定的RNA编辑器。Cas13酶是有利的，因为它们不需要PAM，并且RNA靶向可能是可逆的，因为没有基因组编辑。一些CAS13酶需要与目标相邻的单个基地原始侧面序列（PFS），但是许多不具有，显示该系统的灵活性。

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注意：Jen云顶娱乐 韦德国际nifer Tsang和Mary Tearing有助于更新这篇文章。

参考

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