第一次使用AAV的提示(新手)

由Beth Kenkel.

我实验室的选择的传染媒介是AAV,几乎每个需要AAV的实验。在加入我的实验之前,我从未与AAV一起工作,所以自然地我必须为我的第一个实验包装一些病毒。这有点令人恐惧,但我有我的实验室的协议和一些伟大的同事帮助我。即使使用这些工具,我发现自己也将Aav生产技巧写成了我协议的边缘。虽然这些提示对实验并不重要,但它们绝对让我的生活更轻松!在这篇文章中,我会分享一些AAV生产,净化, 和滴定同时总结了包装AAV所需的基本步骤和分析。

AVV的生产、纯化和滴定

AAV生产

概述:包装AAV的第一步是用AAV包装质粒转染HEK293细胞。细胞需要三种不同的质粒来产生AAV:1)Repcap质粒,其提供AAV复制(Rep)和衣壳(帽)基因。AAV复制使用宿主的聚合酶,但需要Rep蛋白以将双链中间体加工成单链基因组,然后包装成Aav的蛋白质壳或衣壳;2)表达腺病毒基因介导AAV病毒复制的pHelper质粒;3)转移质粒,它编码一种被包装到病毒中的转基因。转染后2 - 5天,收集并纯化含有aav的细胞和培养基。总的来说,这一过程需要4-7天,还不包括HEK293细胞扩增所需的时间。检查Addgene AAV生产协议为更多的细节。

专业提示

  1. 我不会撒谎,AAV转移质粒是一种痛苦的工作。这些质粒含有适当包装AAV所需的ITR,而且还形成易于从转移质粒缺失的二次结构。好消息是有一些简单的方法来处理这个问题。一种方法是在30℃下以30℃而不是37℃来生长多种细菌培养物,而是用a的ITR重组筛选SmaI或者XMAI.限制酶消化(ITRS包含SMAI和XMAI限制性位点)。另一种方法是将AAV转移质粒转化为细菌菌株,如内稳定。稳定的感受态细胞缺乏RecA,这是一种帮助类似itr的复制区域的同源重组的蛋白质。限制摘要筛选ITR删除仍然是必要的。

    AAV质粒smi消化
  2. 为了节省时间和金钱,我喜欢Miniprep 5毫升我的AAV转移质粒培养,然后用SMAI消化筛选。我将细菌颗粒冻结为剩余的培养物,后来的Maxiprep只有完整ITR的培养物。

  3. 我使用类似的电子表格这个计划我的AAV包装PEI转染。它节省了我的时间,帮助我弄清楚我是否有足够的质粒来完成我的实验。

  4. AAV通常是我实验的限制试剂,所以我总是制造出比我认为需要的更多的AAV。与慢病毒不同的是,AAV需要较高数量的病毒颗粒为了高效的基因转移。我认为有一点额外的AAV比产生更多的病毒要好因为我没有足够的AAV。

  5. 与Addgene AAV生产协议相比,我采取了一种懒惰的方法来收获我的AAV。我跳过HEK293细胞培养上清液的PEG沉淀,因为准备40%PEG溶液的耗时耗时。PEG在加热的搅拌板上需要几个小时以溶解并且需要监测,以便解决方案不会太热,因为然后钉将分为两个阶段。如果发生这种情况,可以冷却解决方案,并且两个相混合在一起。最后,需要通过过滤灭菌的PEG解决方案,这需要时间,因为溶液是粘性的,或通过高压灭菌,这也需要时间。我选择只收获细胞颗粒,而不是投资所有这些努力。如果我使用PEG降水,但对于我的实验,我的收益率会更高,但是,我单独从细胞颗粒中获得足够的病毒。如果产量很重要,或者如果您使用的AAV血清型的病毒颗粒主要在培养基中发现,您应该考虑进行PEG降水。

  6. 我用这个来裂解细胞,而不是用声波来裂解细胞AAV裂解缓冲并在95%乙醇和干冰浴中冻结/解冻四次,以释放来自细胞的病毒颗粒。然后立即用碘烷醇纯化立即用苯并酶处理细胞裂解物。这种方法给了我一些灵活性,因为在净化AAV之前,我可以在-80°C下将细胞裂解物存放在-80°C上长达6个月(Choi等人)。

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AAV用碘血糖梯度超声纯化

概述:Iodixanol梯度超速离心使用不同浓度的碘司醇梯度将污染物分离出不纯的AAV制剂。仔细分层15%,25%,40%和60%碘烷醇溶液,然后覆盖在AAV生产过程中产生的病毒悬浮液。在超速离心之后,收集含AAV的40%级分,并交换缓冲液以除去碘烷醇并浓缩纯化的病毒。该过程可以在漫长的一天内完成,或者病毒可以在4°C和第二天交换缓冲器。参考AAV Iodixanol梯度超速离心协议为更多的细节。

专业提示

  1. 看这个AAV净化视频!当我第一次进行碘二醇梯度提纯时,它还不存在,但我希望它存在。该视频简要概述了碘沙醇的工作原理,展示了如何创建碘沙醇梯度层,并有一些伟大的指针,同时帮助您掌握碘沙醇AAV纯化。

  2. 如果你是创建梯度的新手,在做第一次净化之前练习制作碘二醇层。这帮助我获得了碘二醇溶液分层的感觉,让我再次检查碘二醇梯度溶液是否准备正确。

  3. 当纯化后的病毒和缓冲液交换后的病毒进行配位时,记得做一到两个小的配位以用于qPCR滴度。这有助于避免病毒的多次冻结/解冻。

qPCR法测定AAV

概述:QPCR的AAV滴定量量化了AAV PREP中存在的含基因组病毒颗粒的数量。首先消化AAV样品以除去从AAV生产过程中携带的任何残留的AAV质粒。可以使用SYBR绿色技术或TAQMAN引物/探针组,并通过与AAV标准曲线进行比较来量化样品,其由含ITR的质粒产生。整个过程需要3小时才能完成:1小时的动手时间和2小时QPCR运行和数据分析。请参阅这一点添加基因AAV的qPCR滴定法为更多的细节。

专业技巧

  1. 计算AAV滴度时,请记住算用于DNASEI消化的样本的稀释。

  2. 使用良好的无菌技术处理您的AAV质粒标准和AAV转移质粒。很容易用质粒污染工作空间,但我不知道这一点……一个无模板对照(NTC)应该总是包括在内。

  3. 虽然QPCR产生的物理滴度是有用的,但是,我测试几种不同浓度的病毒,或多种感染(沼泽),以确定感兴趣的我的细胞的AAV的最佳剂量。每批AAV都需要自己的MOI优化来算用于批量到批量变化。看看这个帖子了解更多关于降低AAV滴度的不同方法。

你有什么AAV制作技巧吗?请在下面的评论中分享!


特别感谢Dan Stone博士和Harshana de Silva Meaixge在Fred Hutchinson Cancer Center教授我关于AAV的生产和净化!

参考

1.aunhammer, C., Haase, M., Muether, N., Hausl, M.A., Rauschhuber, C.T., Huber, I., Nitschko, h.m., Busch, U., Sing, a.s., Ehrhardt, A., & Baiker, A.(2012)。通用实时荧光定量PCR用于检测和定量腺相关病毒血清型2衍生的倒置末端重复序列人类基因治疗方法2318-28。PubMedPMID:22428977.

2. Choi,V.W.,Asokan,A.,Haberman,R.a.,&Samulski,R.J.(2007)。生产重组腺相关病毒载体,用于体外和体内使用。伟德BV下载第16章分子生物学的当前方案16.25、单位。PubMedPMID:18265393

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