一个第1次AAV用户的提示(由新秀AAV用户)

由贝丝学会主席

Beth Kenkel.

我的实验室选择的载体是AAV,几乎每个实验都需要AAV。在加入我的实验室之前,我从未接触过AAV,所以很自然地,我必须为我的第一个实验打包一些病毒。这是有点吓人,但我有我的实验室协议和一些很棒的同事来帮助我。即使有了这些工具,我还是发现自己把AAV生产技巧写进了协议的边缘。虽然这些技巧对实验来说并不重要,但它们确实让我的生活变得更轻松了!在这篇文章中,我将分享一些AAV生产纯化,滴定法提示,同时还总结了包装AAV所需的基本步骤和分析。

AVV生产,净化和滴定

AAV生产

概述:包装AAV的第一步是用AAV包装质粒转染HEK293细胞。细胞需要三个不同的质粒来产生AAV: 1) RepCap质粒,它提供AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。AAV复制使用宿主的聚合酶,但需要Rep蛋白质将双链中间体转化为单链基因组,然后打包到AAV的蛋白质外壳,或衣壳中;2)表达腺病毒基因的豆瓣质粒,有助于介导AAV病毒复制;3)转移质粒,其编码包装成病毒的感兴趣的转基因。转染后两到五天,收获含AAV的细胞和培养基并纯化。总共,此过程需要4-7天,而不计算扩展HEK293细胞所需的时间。看看ADDGEA AAV生产协议更多细节。

专业技巧

  1. 我不打算撒谎,AAV转移质粒是一种痛苦的工作。这些质粒含有itr,这些itr是AAV适当包装所必需的,但也形成了容易从转移质粒上删除的二级结构。好消息是,有一些简单的方法可以解决这个问题。一种方法是将你的AAV转移质粒在30°C而不是37°C下进行多重细菌培养,然后用a筛选ITR重组SmaiXmaI限制性内切酶消化(itr包含smi和XmaI酶切位点)。另一种方法是将AAV转移质粒转化为菌株,比如NEB稳定。NEB稳定的竞争性细胞缺乏RECA,一种蛋白质,其有助于像ITRS这样的重复区域的同源重组。ITR删除的限制摘要筛选仍然是必要的。

    AAV质粒SMAI DIGEST
  2. 为了节省时间和金钱,我喜欢微量准备5ml的AAV转移质粒培养物,然后用smi酶切进行筛选。我将剩下的培养物的菌粒冷冻,然后只对itr完整的培养物进行最大处理。

  3. 我使用类似于这一个计划我的AAV包装PEI转染。它为我节省了时间,帮助我弄清楚我是否有足够的质粒来完成我的实验。

  4. AAV通常是我的实验的限制试剂,所以我总是赚更多的AAV,而不是我需要的。不像劳神病毒,AAV需要更多的病毒颗粒有效基因转移。我认为最好有点额外的AAV,而不是产生更多的病毒,因为我没有足够的AAV。

  5. 与Addgene AAV生产协议相比,我采取了一个懒惰的方法来收获我的AAV。我跳过了HEK293细胞培养上清的PEG沉淀,因为准备40% PEG溶液需要时间。聚乙二醇需要在加热的搅拌板上几个小时才能溶解,并且需要监控以便溶液不会太热,因为这样聚乙二醇就会分裂成两相。如果发生这种情况,溶液就可以冷却,两相就可以混合在一起。最后,聚乙二醇溶液需要灭菌,通过过滤,这需要时间,因为溶液是粘性的,或者通过高压灭菌,这也需要时间。而不是投资所有这些努力准备试剂,我选择只收获细胞颗粒。如果我使用PEG沉淀,我的产量会更高,但在我的实验中,我从细胞颗粒中获得足够的病毒。如果产量很重要,或者如果你正在研究的AAV血清型病毒颗粒主要是在培养基中发现的,你应该考虑进行PEG沉淀。

  6. 我用这个来粘贴细胞来而不是超声处理细胞颗粒AAV裂解缓冲器然后在95%的乙醇和干冰中冷冻/解冻四次将病毒颗粒从细胞中释放出来。在碘二醇纯化之前,细胞裂解产物立即用苯甲酰酶处理。这种方法给了我一些灵活性,因为我可以在纯化AAV之前将细胞裂解物在-80°C下保存长达6个月(Choi等人)。

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碘二醇梯度超滤法纯化AAV

概述:碘二醇梯度超离心法使用不同浓度的碘二醇梯度从不纯的AAV制剂中分离污染物。将15%、25%、40%和60%的碘二醇溶液仔细分层,然后将产生AAV的病毒悬液叠加。超离心后,收集含有40% aav的馏分,交换缓冲液以除去碘二醇并浓缩纯化后的病毒。这个过程可以在漫长的一天内完成,也可以将病毒储存在4°C,隔天交换缓冲液。指的是AAV碘二醇梯度超离心法更多细节。

专业技巧

  1. 看这个AAV净化视频!!当我做的第一个Iodixanol渐变净化时,它不存在,但我希望它有。该视频简要介绍了Iocixanol Pritifications如何工作的简要概述,展示了如何创建IodixAnol渐变层,并具有一些伟大的指针,同时帮助您掌握Iodixanol AAV净化。

  2. 如果您是新的创建渐变,请在第一次净化之前练习制作Iodixanol层。这有助于我感觉到碘依齐索解决方案,让我仔细检查碘血糖梯度解决方案是否正确。

  3. 当调味纯化和缓冲液交换病毒时,记得记得制作一个或两个小等分试样用于QPCR滴度。这有助于避免较大等分试样的多重冻融/解冻。

QPCR的AAV滴定

概述:通过qPCR测定AAV的滴度,可以定量AAV制备液中含有基因组的病毒颗粒的数量。首先对AAV样品进行DNaseI酶切,去除从AAV生产过程中携带的残留AAV质粒。可使用SYBR绿色技术或TaqMan引物/探针集,并通过与含itr质粒生成的AAV标准曲线进行样品定量。整个过程大约需要3小时完成:1小时的实际操作时间和2小时的qPCR运行和数据分析时间。指的是这个QPCR协议的Addgene AAV滴定更多细节。

专业提示

  1. 当计算你的AAV的滴度时,记得考虑样品的dnase消化的稀释。

  2. 处理AAV质粒标准和AAV转移质粒时使用良好的无菌技术。很容易与质粒污染工作区,而不是我知道这一点......应该始终包括一个没有模板控件(NTC)。

  3. 虽然qPCR产生的物理效价是有用的,但我测试了几种不同浓度的病毒,或感染的多重性(MOIs),以确定我感兴趣的细胞AAV的最佳剂量。每个批次的AAV都需要自己的MOI优化,以考虑批次间的可变性。查看这篇文章更多地了解有关Titer AAV的不同方式。

你有AAV生产提示还是技巧?请在下面的评论中分享它们!


特别感谢Fred Hutchinson癌症中心的Dan Stone博士和Harshana de Silva Feelixge教授我有关AAV的生产和纯化!

参考文献

1. Aurnhammer, C., Haase, M., Muether, N., Hausl, M.A., Rauschhuber, C.T., Huber, I., Nitschko, H.M., Busch, U., Sing, A.S., Ehrhardt, A., & Baiker, A. (2012). Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.人类基因治疗方法,23 1, 18-28。PubMed.PMID:22428977

2.Choi, v.w., Asokan, A., Haberman, r.a., & Samulski, R.J.(2007)。生产体外和体内使用的重组腺相关病毒载体。伟德BV下载分子生物学的现行协议,第16章,单位16.25。PubMed.PMID:18265393

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