拟南芥转化提示

由Guest Blogger.

这篇文章由劳拉·李贡献,斯坦福大学的研究生。

Arabidopsis是一个梦幻般的模型生物,其原因很多,并非最不重要的是转型。有许多动力产生转基因拟南芥,从研究生物植物中基因和蛋白质的转录和翻译动态,以补充突变表型。拟南芥适于花的滴水或浸渍转化方法。该方法的一般步骤包括:

  • 克隆和将质粒转化为细菌农杆菌突厥 -一种植物致病性物种,可稳定地将转移DNA(TDNA)与IT攻击植物的基因组
  • 生长转化的土壤杆菌培养物
  • 浸入农杆菌培养中的植物的花朵,以允许TDNA插入植物的种系
  • 选择具有TDNA插入的种子(通常通过含抗生素培养基上的种子生长)

类似的过程也发生在自然界中;农杆菌TDNA插入可能会沉淀甘薯的驯化(Kyndt.等等。,2015年) !这听起来很简单,实际上也很简单,但是有一些技巧和技巧可以用来获得最佳的转换效率。从转化到获得可分析的转基因可能需要6-8周的时间,所以第一次正确处理这个过程是非常重要的。我将在这里列出一些指导方针。详细的转换协议,以及用于增长的协议拟南芥也可用(Weigel和Glazebrook,2002年)。

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选择表达式系统

选择合适的表达载体是产生转基因拟南芥的第一步。有一堆很棒的选择,但这里有几个我的最爱。来自Tsuyoshi Nakagawa实验室的质粒二进制网关向量并且可用于启动子交换和产生N和C末端标记的融合蛋白,用荧光(YFP,GFP,CFP,RFP等)或亲和标签(HA,FLAG)。还有各种植物选择标记(Basta,Hygromycin,Kananamycin,Tunicamycin)(纳卡瓦等等。,2007年)。或者,如果您更喜欢金门组件,有一系列来自Dinneny实验室的质粒另外还允许根据种子中RFP的表达从视觉上选择转化子(Emami, Yee和dinney, 2013)。

制备转型植物

无论你转化为什么植物都会成为你的T0代。当他们开始开花时,这些植物将准备好转换。在开花开始后,不久的情况很重要。如果您的植物在您的构造准备转换之前开始花,您可以切断阀杆底部附近的主要花序(植物的开花部分)。这让您在新的花序开始生长之前给您带来几天。这也将增加整体花序的数量,这可能会提高变换效率。如果你看到许多成熟的单体(种子荚),你的植物可能太古老而无法改变。这种转变仍然可以起作用,但效率将会很低。

尖端:

  • 使用健康植物:您的植物应显示不应力的迹象,如花青素生产,或疾病,如真菌生长。健康的植物产生很多种子。更多种子意味着更多的机会回收转化体。
  • 使用年幼的植物:如果你早早转变,你的植物仍然有足够的时间在你暴露花后产生种子农杆菌。更多种子意味着更多的机会回收转化体。
  • 使用大量的植物:大量的植物产生大量的种子。我通常在每一个构造中使用8-10个植物。更多种子意味着更多的机会回收转化体。
  • 在转化之前去除成熟的单片机:在转化之前成熟的单片机恰好是您知道不会留下您的转基因的种子。您可以选择删除它们以减少池中的非转换种子的数量,您将从以后选择。

拟南芥转换过程

过程本身很简单。当您的农杆菌培养准备好时,将它们旋转并将其重新悬浮在转换介质中。如果你蘸了你的植物,将文化放入足够宽的容器中,以便在里面扣篮。50毫升Falcon管或塑料称重船对此有很大的选择,具体取决于您选择的培养量。你会得到农杆菌全部穿过手套,所以如果您一次转换多于一个结构,请务必改变构造之间的手套。

Arabidopsis Tranformation.

用于详细协议,卷,旋转速度,食谱和农杆菌菌株看Weigel和Glazebrook,2002年

尖端:

  • 做A.菌落PCR在你的农杆菌上:获得一个转化体需要很长时间。确保您生长的农杆菌培养肯定含有您的质粒。
  • 成长很多农杆菌:您将植物暴露的农作用率越多,您就越有可能获得变革者。我喜欢旋转100毫升培养物并重悬于25毫升的转化培养基中农杆菌压力。此外,转换过程可能会有点混乱,所以您需要确保有足够的容量来浸泡所有的植物。
  • 确保你的农杆菌文化不受耐受:农杆菌需要活着感染你的植物。如果您的培养物在固定阶段孵育过长,则文化中的细胞将不再可行。这需要的时间取决于您使用的培养量,以及您是否接种来自冻结的股票或从LB板的殖民地。在我手中,5毫升从板上的殖民地接种的5毫升起动培养物将在18-24小时内达到最佳密度。然后将0.5ml这种起始培养物加入100mL新鲜培养基,然后在另外24小时内随时使用。剩余的起动培养物可用于菌落PCR和甘油股。
  • 浸渍/滴灌厂多次:浸泡植物,让他们恢复一周,然后再次浸。这不会伤害它们,它将增加TDNA集成的机会。

选择拟南芥转化体

一旦你的T0植物种子干燥,就可以选择转化体。从每个转换中选择多个T1工厂非常重要。我喜欢至少隔离五个。您无法控制发生有多少插入。具有太多插入可能导致来自过度表达的伪像,可能在随后的几代内沉默这种构造。您会知道您是否获得了单一插入的转型体,因为它将在T2代代中分离3:1。您也无法控制您的构造将插入的位置。如果您的插入发生在编码区域中,它可能会导致意外的表型。对于大多数表型分析,开始在T2代中工作是合适的。选择过程本身可能会影响抗性植物的生长,因此您将想知道您在没有选择的情况下插入的效果。

关于抗生素选择的方案,请查看哈里森等等。,2006年

尖端:

  • 在选择期间不太密集地铺板种子:这将增加非转化体的背景生长,并使真正的转化体更加困难。
  • 不要将植物留在选择性板上过长:甚至耐药植物最终会受到选择的影响。
  • 基因型推定T1转化体:当您的T1在土壤上并从选择的应力中恢复时,可以夹住叶子并提取基因组DNA进行基因分型。这不会伤害您的植物,而T1的基因型比T2更容易。您的转基因不应在T1中隔离,但它可能会在T2中。

爆头Laura Lee是斯坦福大学的研究生。她在气孔谱系中研究细胞命运维护,并在该过程中制造了无数的转基因植物。

参考文献

1. emami,s.,yee,m。和dinneny,J. R.(2013)'植物合成生物学的强大金门土壤载体家族',植物科学前沿,4. DOI:10.3389 / FPLS.2013.00339。PubMed.PMID:24032037。pmed中央PMCID:PMC3759027

2哈里森,S. J.等等。(2006)“鉴定拟拟合拟南芥籽幼苗”的快速和稳健的方法,如花卉DIP转换,工厂方法。生物化中央,2(1),p。19. DOI:10.1186 / 1746-4811-2-19。PubMed.PMID:17087829。pmed中央PMCID: PMC1636043

3. Kyndt,T.等等。栽培甘薯的基因组包含了表达基因的农杆菌t - dna:自然转基因食品作物的一个例子。美国国家科学院的诉讼程序。国家科学院,112(18),PP。5844-9。DOI:10.1073 / PNA.1419685112。PubMed.PMID:25902487。pmed中央PMCID:PMC4426443

4. Nakagawa,T.等等。(2007)'改进的网关二进制矢量:用于在植物转基因分析中创建融合构建体的高性能载体,生物科学,生物技术和生物化学, 71(8), pp. 2095-2100。doi: 10.1271 / bbb.70216。PubMed.PMID:17690442

5.Weigel, D.和Glazebrook, J. (2002)拟南芥:实验室手册。冷泉港实验室新闻。可用于:https://books.google.at/books/about/arabidopesis.html?id=ifzamnpwvk4c&edir_esc=y.(访问:2018年9月21日)。

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