用于初步您的慢动动力制剂的提示

由Meghan Rego.

梅根雷科


病毒滴度模糊这一天已经到了;你已经痛苦地照顾你的包装细胞系,准备你的DNA,转染和收获你的母养血牙。现在是时候前进了你的感染并制作稳定的细胞系。虽然我们都经历了向前移动一个项目的压力,但不应冲进转换。在开始任何转换之前,您应该始终滴定您的病毒 - 即确定您在准备中实际拥有的病毒量。花时间妥善滴定您的病毒,不仅可以确保您的感染是以最好的方式设计的,但它也可能节省您的时间长期。请继续阅读初步选项的概述以及不同方法的益处和缺点(对于此处讨论的所有方法的综合协议,请参阅
Kutner等。al。)。

物理与功能滴度

病毒滴度通常有两种口味,物理或功能。物理滴度测量样品中的病毒颗粒的量,通常基于病毒蛋白,例如P24或病毒核酸的存在。功能性滴度或感染性滴度,测量产生的有多少病毒颗粒实际上可以感染细胞。这些测定通常涉及用病毒感染靶细胞系,并测定转移质粒上携带的基因的表达,或者定量整合到靶细胞基因组中的病毒拷贝数。

物理滴度

包装和滴度慢病毒物理滴度的两个最常见的测定是通过ELISA和QPCR进行直接P24测量,用于病毒RNA。测量病毒准备中的P24水平是简单快捷的,因为有几种商用P24 ELISA套件这可以在几个小时内量化P24水平。然而,这种方法的主要缺点是P24 ELISA在样品中测量所有p24,而不管是否掺入病毒颗粒中。因此,基于P24定量的滴度趋于高估,因为它们可包括游离P24和有缺陷的病毒颗粒。

直接测量慢病毒RNA是直接P24测量的一种替代方案。与P24 ELISA一样,这种方法相对较快,在不到一天的情况下提供结果,但往往比ELISA套件更便宜。在这种方法中,首先将病毒RNA转化为cDNA,然后使用QPCR引物定量靶向特异性病毒组件如LTR,GAG,WPRE,抗生素抗性 - 基因或转基因本身。许多研究人员更喜欢设计靶向病毒载体骨架的共同特征的引物;一旦经过验证,这些通用的引物可用于拖动任何慢动力的准备,这些准备将该特定特征分享。靶向转基质的引物也有益,因为它们确保在转染中使用正确的转移质粒;如果并行制备几种不同的慢病毒,应考虑这种方法。

类似于P24测定,通过测量病毒RNA的滴度可以在预洗涤中估量感染性病毒的量,因为测量将包括缺陷颗粒。研究发现价值可以是10-1000折更高而不是根据载体骨架的功能测定。当使用基于QPCR基于QPCR的方法考虑使用逆转录酶突变体在单独的对照反应中考虑。这将允许您量化来自易于膨胀结果的原始质粒的PCR产物量。一种逆转录酶的包装载体缺乏将产生低水平的病毒,可用于跟踪携带。

功能滴度

量化有多少细胞被感染功能性滴度被认为是一种更准确的方法来量化病毒,因为它只测量传染性病毒颗粒。测量功能滴度的最简单方法之一使用FACS计数载体编码转基因表达的靶细胞的数量,用于通过串联稀释液的转导后进行转导。当使用携带荧光标记物的载体时,该方法特别有用,因为它消除了对抗体染色的需要。

查看我们深入的荧光滴定协议

另一种流行的方法利用了抗生素抗性基因携带转移质粒。用抗生素处理的病毒制备的连续稀释液转导靶细胞,并定量菌落形成单位。虽然这些方法往往比测量物理滴度更准确,但是由于这些测定不能区分具有一体化进入其基因组的病毒颗粒和具有多个集成事件的细胞的细胞,它们可能低估病毒滴度存在风险。。此外,启动子选择还可以影响转基因表达。

慢病毒滴定的最准确方法使用QPCR来测量整合到目标细胞基因组中的透过拷贝的数量。这种方法可以区分多个集成事件,从而降低低估病毒滴度的可能性。这种方法的主要缺点是它可以是相当劳动密集型的。用病毒制备的连续稀释液转导靶细胞,分离的基因组DNA,靶向病毒成分或转基因本身的引物用于量化集成事件的数量。这种方法的另一个缺点可以是没有合适的控制。对这种类型测定的最佳控制是已知含有QPCR靶基因的1个集成拷贝的克隆细胞系。显影适当的控制线通常需要通过限制多重感染(MOI)来转换,以确保仅基于表面标记,亚克隆,膨胀和确认的表达,通过抗生素抗性或单细胞分选选择一份拷贝。此程序可能需要几个月,但应在实验室中考虑,该实验室将经常生产病毒或需要精确滴度。

滴度慢病毒的其他考虑因素

体积和转导时间将影响慢病毒滴度,同时使用靶细胞类型。因此,在比较不同批次的病毒时使用标准条件至关重要。此外,一些病毒制剂对冻融循环非常敏感;用新鲜收集的慢病毒预备测量的滴度可能明显高于储存在冰箱中的相同的准备。如果您计划冻结一批病毒进行长期使用,您可能需要考虑使用已经过冻结/解冻周期的等分试样进行初步,因为这将更好地代表未来的实验。

上述初步选项都有他们的好处和缺点。不常规产生病毒的实验室可能希望选择更直接的方法,例如基于FAC的或菌落形成单元测定,而常规产生病毒的实验室可能希望考虑更准确的透过透过整合测定。在任何一种情况下,正确滴定您的病毒准备是成功进行转换实验的关键第一步。

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参考

1。Kutner,Robert H.,Xian-Yang Zhang和Jakob Reiser。“伪型HIV-1的慢病毒载体的生产,浓缩和滴定”。伟德BV下载自然协议4.4(2009):495-505。PubMed.PMID:19300443

2。Geraerts,Martine等。“慢病毒载体滴定方法的比较。”BMC生物技术6.1(2006):1。PUBMEDPMID:16836756。pmed中央PMCID:PMC1534021.

3.张,Bing等人。“慢病毒载体滴定中受控条件的意义和使用多种感染(MOI)来预测基因转移事件。”遗传疫苗和治疗2.1(2004):1。PUBMEDPMID:15291957.。pmed中央PMCID:PMC514534

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