用CRISPR基因编辑治疗肌肉萎缩症

由玛丽传动装置

看到CRISPR的基础研究取得成功后,研究人员渴望将其应用于临床。CRISPR常被用于动物种系修饰,修复或添加致病突变,但直到最近它还没有被用于产后疾病的治疗。现在,同时发表在《科学》杂志上的三篇论文CRISPR可以治疗出生后的遗传疾病小鼠模型,是未来临床前和临床工作的重要概念证明。

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杜氏肌萎缩症:最常见的遗传性疾病

目标基因疾病是杜氏肌萎缩症(DMD),这是一种x连锁的隐性疾病,大约每5000名男性中就有1人患病。DMD主要是由肌营养不良蛋白(一种正常肌肉功能必需的蛋白质)的移码突变引起的。如果肌萎缩蛋白不起作用,一个人在30岁左右会经历渐进式肌肉萎缩,最终导致死亡。尽管对DMD进行了大量的研究,但仍然没有好的治疗方法。

肌营养不良基因非常大(79个外显子),但大部分序列似乎不是必需的。在抗肌萎缩蛋白的突变热点外显子45-55中,有多个共同的缺失保持蛋白质的阅读框架,导致产生一个较小的,但至少部分功能的蛋白质。带有这些突变的个体通常无症状,或只有轻微的症状,这种情况被称为贝克尔肌营养不良(BMD)。

Dystrophin的大小使得它很难通过基因治疗来传递,所以研究人员把目光投向了另一种方法。由于较短形式的抗肌萎缩蛋白仍然有功能,外显子跳跃是治疗DMD的一个好选择。临床试验使用寡核苷酸外显子跳跃式(OEN)来移除肌萎缩蛋白转录本的突变外显子。不幸的是,这种寡核苷酸只能适度地改善肌肉功能,而且必须定期注射。

肌萎缩蛋白和基因组编辑

由于复杂的寡核苷酸治疗带来了许多挑战,研究人员已经开始探索基因组编辑方法的外显子跳跃。Addgene储户查尔斯Gersbach使用成对锌指核酸酶移除DMD患者成肌细胞的第51外显子。他们观察到第51外显子的去除率为13%,这导致了适当的局部抗肌营养不良。在一个随后的研究,他们使用CRISPR与两个grna在患者成肌细胞中删除51外显子或45-55外显子;当被注射到DMD小鼠体内时,这些细胞表达功能性抗肌萎缩蛋白。

编辑基因在活的有机体内当然要比细胞培养困难得多,但是跑等已经证明,CRISPR和AAV可共同用于小鼠出生后基因组编辑。这种方法能与肌萎缩蛋白外显子跳过一起工作吗?这样的治疗要成功,必须满足多种要求。首先,CRISPR需要被运送到心脏和骨骼肌细胞,在那里对肌营养不良基因进行精确编辑,偏离目标编辑的风险最小。为了让治疗持续下去,干细胞编辑是非常可取的。如果发生干细胞编辑,CRISPR成分只需要短时间表达,这将防止不必要的突变随着时间的推移积累。

DMD是CRISPR概念治疗的一个很好的选择,因为这种疾病特别适合基因组编辑。的homology-directed修复(HDR)在成熟组织中通路被下调-没有问题,因为外显子跳过通过非同源端连接(NHEJ)途径。据估计,只有很少的抗肌营养不良纠正(大约4%)需要看到肌肉改善,只有30%需要纠正正常功能。即使是低频编辑也可以对DMD产生巨大的影响,据估计外显子跳跃疗法将适用于80%的DMD患者。

杜氏肌萎缩症的外显子跳过策略

长等。,纳尔逊等。,Tabebordbar et al。他们都选择在DMD小鼠中尝试外显子跳跃,这些小鼠的肌营养不良蛋白23外显子发生了突变。Long等人使用SpCas9联合AAV9,而Nelson等人和Tabebordbar等人使用较短的SaCas9分别使用AAV8和AAV9。尽管每项研究使用的方法略有不同,但他们都在心脏和骨骼肌中观察到了相同的阳性表型。即使当基因组编辑频率较低时,外显子跳过mRNA的相对丰度也较高,这可能是因为这种mRNA不受无意义介导的衰变的影响。虽然Nelson等人在一项实验中只观察到2%的基因组编辑,但他们发现外显子跳过的转录本占dystrophin mRNA总量的59%,与Tabebordbar等人观察到的39%相似。Long等人发现肌萎缩肌细胞的表达百分比随着时间的推移而增加,三组均通过Western blot证实肌萎缩肌细胞的表达低于野生型水平的10%。肌肉组织学得到改善,与未编辑的动物相比,炎症和坏死大大减少。在握力、比力和其他肌肉测试中,肌肉功能明显改善,尽管没有达到野生型水平。关于脱靶效应,每一组发现在10个最高的预测脱靶地点脱靶活动很低或没有。

每一篇论文都描述了CRISPR DMD治疗的其他独特方面。Long等人的研究表明,AAV-CRISPR不会引起明显的种系修饰,这是一个重要的发现考虑到与这样的编辑相关的争议。Tabebordbar等人表明,肌肉干细胞被这种方法修饰,增加了编辑将长期持续的可能性。根据这一结果,Nelson等人发现,肌萎缩蛋白恢复维持至少6个月。

临床CRISPR编辑的未来方向和障碍

鉴于crispr介导的外显子跳跃方法在小鼠中的成功,DMD研究人员非常兴奋。这种方法也可能适用于一些由拼接缺陷引起的罕见遗传病,包括毛细血管扩张共济失调、先天性糖基化障碍和尼曼-皮克病c型。尽管这里引用的三项DMD研究代表了CRISPR基因治疗的一大进步,认识到DMD比我们想用CRISPR治疗的其他遗传疾病更简单是很重要的。如上所述,DMD可以通过“一刀切”的nhej介导的编辑来治疗,但大多数其他疾病需要hdr介导的针对较小患者群体的精确编辑。

要使DMD CRISPR疗法更接近临床,仍需做大量工作。首先,CRISPR交付必须优化到:

1.达到全身肌肉细胞的高百分比,特别是干细胞

2.去除AAV载体的免疫原性

一旦分娩被优化,确定拯救表型将持续多久是很重要的,更重要的是,如果它确实延长了寿命。这项工作应该在人类相关外显子45-55突变的小鼠和大型动物模型中进行,而不是在传统的23外显子突变的小鼠模型中。肌肉中潜在的脱靶效应,以及不必要的种系编辑,必须经过长时间的严格检查。高保真cas9等eSpCas9和SpCas9-HF应该探索减少脱靶编辑。短期CRISPR表达尤其可取,因为随着时间的推移,它将减少脱靶编辑的可能性,但这种方法需要强大的干细胞编辑来保持所需的表型。

精确基因组编辑面临着以上甚至更多的挑战。一个主要的挑战是在成熟组织中上调HDR,因为这一过程是精确编辑点突变所必需的。除了上调HDR,还必须下调NHEJ,以防止CRISPR引入新的突变;编辑外显子区域比使用外显子跳跃方法的内含子编辑具有更大的风险。在大多数遗传疾病中,突变景观是广泛和多样的,需要开发许多不同的CRISPR疗法来匹配这些不同的突变。对于每种疗法,有效性和脱靶风险必须分别评估,增加了临床批准的时间。

即使在精确编辑面临挑战的情况下,在DMD更可行的情况下看到这样的进展是令人鼓舞的。如果这种方法的安全性和有效性得到优化,DMD可能成为第一批使用CRISPR进行临床治疗的疾病之一。CRISPR基因编辑仍然存在许多障碍,但考虑到该技术的发展速度,精确编辑处理可能也比我们预期的更接近。 下载Addgene的CRISPR 101电子书!


参考文献

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