伟德BV下载病毒载体101:部分AAV包装质粒

由Beth Kenkel.

你下一个很酷的实验需要一些AAV。你从哪里开始?质粒当然!你只需要三个质粒就可以开始了制作AAV您需要您的实验:

  1. 包装质粒其中包含AAV的结构和包装基因,
  2. adenoviral辅助质粒其中含有病毒复制所需的蛋白质,
  3. 转移质粒其中包含病毒基因组。

在今天的博客中,我们将关注包装质粒,并看一看它的每个部分。

AAV包装质粒的关键元件

包装质粒又名RepCap质粒编码两个基因复制(REP)基因和衣壳(帽)基因。在野生型AAV中,这两个基因位于AAV基因组的两个反向末端重复序列(ITRs)之间;但当重组AAV (rAAV)在实验室制造时,rep从单独的质粒表达在跨,在病毒基因组中释放空间,使得感兴趣的基因可以包装到病毒中。

接下来让我们仔细看看rep基因。

RepCap质粒在rep编码区包含三个启动子,分别编码4种不同的rep蛋白。这个区域还编码三个不同的VP蛋白,MAAP蛋白和AAP蛋白。
图1所示。RepCap质粒及其产物。创建BioRender.com

复制(rep)基因

rep基因编码病毒基因组复制和包装所需的四种蛋白质:REP78,REP68,REP52和REP40。代表基因表达通常由AAV p5或p19启动子驱动,分别产生大的(Rep78和Rep68)和小的(Rep52和Rep40) Rep蛋白。选择性剪接产生Rep蛋白的不同c端区域。虽然Rep78和Rep68独特的n端结构域包含一个dna结合和内切酶结构域,但所有4个Rep蛋白共享一个解旋酶和atp酶结构域。函数,REP蛋白形成REP 78/68或REP52 / 40的低聚物。

Rep78/68在AAV基因组复制中起关键作用。转移质粒上含有dsDNA区域的AAV基因组ITRs引发复制。为了生成DNA复制所需的3’羟基,Rep78/68结合ITRs中的Rep结合元件(RBE),利用其内切酶活性生成ssDNA底物,然后被其内切酶结构域断开。复制后,Rep78/68与AAV基因组相连,并与基因组连接到组装好的衣壳上。然后Rep52/40也会结合衣壳,通过衣壳上的一个孔将基因组“泵”到衣壳中。Rep蛋白也参与了驱动Cap表达的AAV p40启动子的转录调控。

通常,来自AAV2血清型的Rep蛋白用于将被Aav2 ITR的载体基因组包装成除AAV2之外的衣壳中。这种生产策略称为交叉包装。

衣壳()基因

基因编码三种AAV病毒衣壳蛋白VP1、VP2和VP3,它们共同形成保护病毒基因组的外衣壳。AAV基因的p40启动子通常是驱动的。选择性剪接和不同的翻译起始位点产生了三个VP蛋白。三个VP蛋白质组装成衣壳1:1:10比(VP1:VP2:VP3)。有十一个自然发生的AAV血清型已经确定:AAV1-11。9个区域的变化AAV血清型之间的不同基因导致了组织和/或细胞型取向中血清型特异性的差异。将变化和/或短肽序列引入这些可变环是改变衣壳向性的一种方法。

还编码装配激活蛋白(AAP)和最近发现的膜相关附属蛋白(MAAP),从另一个开放阅读框架(ORF)。而AAP促进病毒粒子组装的作用Maap尚未明确定义。

现在你对AAV Repcap质粒有了基本的理解!查看此博客文章以了解更多信息AAV传递质粒!

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