伟德BV下载病毒载体101:部分AAV转移质粒

由贝丝学会主席

所以你有了这个很棒的实验,但它需要一些AAV。你以前从未与AAV合作过,但你不会让它阻止你。你从哪里开始?就像所有优秀的实验一样,制造AAV从一些质粒开始。你只需要三个质粒就可以开始了使AAV:

  1. 包装质粒其中包含结构基因和包装基因,
  2. adenoviral辅助质粒里面含有病毒复制所需的蛋白质
  3. 转移质粒其中包含病毒基因组。

在今天的博文中,我们将重点关注AAV转移质粒,并看一看它的每个部分。

含有病毒基因组的AAV病毒。这就放大到了AAV病毒基因组的标记。病毒基因组最大为4.4 kb,包括一个ITR、启动子和转基因基因。选项元素有LoxP站点、WPRE和pA。
图1:AAV转移质粒部分。绿色部分为AAV质粒的关键成分。灰色部分是可选顺式调节元件。

AAV质粒的关键元件

首先我们来谈谈AAV质粒的关键部分。

反向终端重复(ITR)序列

反端重复序列(ITRs)使AAV转移质粒成为AAV转移质粒。ITR序列各145个碱基,AAV质粒有两条ITR序列。itr之间的DNA序列被打包成AAV分子。itr之外的东西不会被打包到AAV载体中。ITRs间的克隆能力约为4.4 kb。

由于其二级结构、回文性质和高GC含量,itr本身是不稳定的。这种不稳定性会导致常规质粒传播过程中ITR的部分丢失,而ITR的完全丢失将使AAV包装失效。为了防止ITR损失,最好在重组缺陷菌株(如Stbl3s)中传播AAV构建体。ITR损失可以通过酶的限制性消化检测,如smi,它在ITR中有识别位点。由于itr的二级结构和高GC含量,常规的Sanger测序通常无法通过itr进行测序,但一些公司现在提供了Sanger测序条件,可以读取这个具有挑战性的序列。

转基因

转基因是由AAV传递的基因。在质粒图上,其序列位于itr之间。它可以是任何你喜欢的,只要它是~4.4 kb或更小。一些例子包括像GFP这样的记者,一些较小的CRISPR-Cas蛋白质,如SaCas9CRISPR gRNAs,或者你感兴趣的基因。

启动子

启动子驱动AAV基因的表达。在质粒图上,启动子位于它们所控制基因的上游或5 '端。启动子可以是生物或组织类型特定的,这可以帮助你限制你的转基因表达到一个特定的物种或位置。启动子也可以驱动不同水平的表达。例如,CAG是一个强大的启动子,驱动非常高的,普遍的表达,而人突触蛋白1启动子具有神经元特异性(Haery等,2019)。大多数AAV转移质粒都有启动子,但如果转移质粒含有非编码序列,则不需要启动子。

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其他基因元素

接下来我们来谈谈一些不是AAV转移质粒所必需的,但却经常在其中出现的元素。

液态氧的网站

Lox位点,结合Cre重组酶,用于在空间和时间上控制转基因表达。Lox位点是定向的34 bp序列,位于转基因侧翼和itr之间。转移质粒通常有两对lox位点,这是双lox系统的一部分,称为FLEX或者戴奥。

Lox位点被重组酶Cre识别。Cre第一fl插入第一对lox位点之间的序列,然后前女友切出第二对之间的序列。最终的结果是一个永久翻转的转基因。通过限制Cre的可用性,lox位点可以让研究人员控制转基因的空间和时间激活。

Cre-lox
图2:FLEX creo - lox系统。

WPRE

土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调节元件(WPRE)在转录时形成一个三级结构,它有助于mRNA的核输出,并有助于增加你的转基因的表达。WPRE位于AAV基因组的末端,就在最终ITR的上游。

多聚腺苷酸化或多聚a信号有助于RNA的核输出和RNA翻译,并促进RNA转录延长。polyA位于AAV基因组的末端,位于最终ITR的上游和WPRE的下游。

TL,博士?观看我们的AAV转移质粒视频!

现在你已经对一些常见的AAV质粒元素有了一个基本的了解!虽然还有许多其他的AAV质粒元素和组合没有在这篇文章中讨论,但你已经获得了能够设计一个成功和具体表达你感兴趣的基因的构造的知识。


参考文献

Haery L, Deverman BE, Matho KS, Cetin A, Woodard K, Cepko C, Guerin KI, Rego MA, Ersing I, Bachle SM, Kamens J, Fan M(2019)腺相关病毒技术和靶向神经操纵的方法。前神经13:。https://doi.org/10.3389/fnana.2019.00093

Wilmott P, Lisowski L, Alexander IE, Logan GJ(2019)腺相关病毒反向末端重复序列用户指南。人类基因治疗方法30:206-213。https://doi.org/10.1089/hgtb.2019.276

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