用CRISPR-SIRIUS可视化基因组基因座

詹妮弗云顶娱乐 韦德国际曾

催化死Cas9蛋白(DCAS9)是众所周知的,其能够在不改变它们的情况下结合DNA靶标的能力。因此,它已广泛适用于各种应用:基础编辑,CrispRP激活和抑制等。在过去的几年里,DCAS9也成为一个强大的可视化工具研究染色体的空间和时间安排以及这些安排如何影响核过程。最新的这些可视化工具是CRISPR-SIRIUS.是最亮的CRISPR的基于迄今为止的基于奖励的工具,用于在活细胞中可视化基因组基因座。

以前使用CRISPR的基因组基因座可视化工具的先前迭代

2015年,Thoru Pederson的实验室在马萨诸塞大学医学院开发了一个基于DCAS9的多色标记系统以在人体细胞中可视化染色体基因座Ma等人。,2015年)。为此,它们将不同的荧光蛋白融合给各种Cas9变体,SPCAS9,NMCAS9和ST1CAS9。这些融合基于引导RNA序列本地化为特定基因座。

一年后,他们开发了Crisprainbow.Ma等人。,2016年),一组GRNA支架,其含有两个发夹序列(MS2,PP7或BOXB),其各自促进与感兴趣的基因组基因率不同的荧光蛋白(BFP,GFP或RFP)。一对GRNA内的相同发夹将导致蓝色,绿色或红色读数。但含有两种不同发夹的GRNA将根据发夹组合产生二次颜色(黄色,青色或洋红色)。包含所有三位发夹的GRNA产生白色。虽然Crisprainkbow允许在生物细胞中同时可视地可视化位点,但该系统需要在基因组中的高拷贝染色体特异性基因座,并且引导件相对不稳定。

CrisPrainbow Multicolor标签

开发Crispr-Sirius

最近,汉语马和Thoru Pederson Lab开发了CRISPR-SIRIUS(Ma等人。,2018年)。它们通过增加GRNA稳定性来改善以前的基于CRISPR的基因座可视化工具。

首先,他们开始了西兰花适体系统在活细胞中可视化GRNA。西兰花适体是结合小分子的核酸序列,DFHBI-1T诱导其荧光。他们发现,在GRNA向内级(GRNA内的四个基部发夹环形图谱)中的适体插入导致比在GRNA的3'末端插入APTamer时更稳定的GRNA。

由于MS2和PP7 RNA发夹序列在CrisPrainkbo中的成功,他们知道他们可能是进一步发展的好候选人。它们将MS2发夹的八位字节插入GRNA TetraloOp,并经过随后的设计迭代,以提高稳定性,并最大限度地减少在将CRISPR-SIRIUS送入细胞中所需的病毒产生期间的错误折叠和重组。他们将此指南命名为SGRNA-Sirius-8xMS2,它将用红色荧光配体招募Halotag到感兴趣的基因座。

双色检测

为了同时标记两个基因座,MA和Pederson创建了另一个包含PP7发夹序列(SGRNA-Sirius-8xpp7)的SGRNA,以招募GFP到感兴趣的基因座。为了确定SGRNA-SIRIUS-8XPP7和SGRNA-SIRIUS-8XMS2支架的表现如何,它们将它们与Crisprainkbow进行了比较。这两个工具都是针对的FBN3.含有22个拷贝的GRNA靶位点的内肠重复。除了提高亮度之外,还发现噪声比的信号可以从2倍(通过Crisprainbow)增加到3倍,用CrispRum-sirius增加到3倍。

三重色彩检测

利用含有交替的MS2和PP7序列的第三个SGRNA(SGRNA-Sirius-4x(MS2-PP7)),其在感兴趣的位置导致黄色荧光,该团队可以可视化三个基因座并测量轨迹间距离。它们通过靶向含有≥20拷贝的GRNA靶位点的46个重复基因座,在染色体19上测试该系统。其中,46个基因座中的26个在人U2OS细胞中产生了可检测的信号。基于此,它们选择基因总DNA区域(IDR3)作为参考基因座,以测量来自基于基因中心,内肾区域和脑卒中区域的基因座对的轨迹距离。所有对都很容易可视化,结果与U2OS细胞的拷贝数变异(CNV)分析一致。

CRISPR SIRIUS Tricolor标签

为什么尝试Crispr-Sirius?

所有工具都在那里可视化基因组基因座,是什么让Crispr-Sirius独特?与荧光不同原位杂交,基于CRISPR的可视化工具可用于直播电池。与其前身Crisprainkbow相比,Crispr-Sirius更亮,使其适合观察低拷贝基因组基因座或单拷贝基因。如果您想明亮地可视化基因组基因座,请尝试播放Crispr-Sirius。

在addgene中发现Crispr-sirius质粒。


参考

马,汉语等。“人体细胞中染色体基因座的多色克切片标记。”美国国家科学院的诉讼程序112 10(2015):3002-7。PubMed.PMID:25713381pmed中央PMCID:PMC4364232

马,汉语等。“使用CrisPrainebobebour与DCAS9和工程SGRNA的基因组基因座的复用标记。”自然生物技术34(2016):528-530。PubMed.PMID:27088723pmed中央PMCID:4864854

马,汉语等。“Crisp-Sirius:用于基因组成像中的信号放大的RNA支架。”自然方法15(2018):928-931。PubMed.PMID:30377374

addgene博客上的其他资源伟德体育中心

addgene.org的资源

下载addgene的crisprup 101电子书!

话题:克里普尔克Crispr想象

发表评论

分享科学刚刚变得更容易...订阅我们的博客

订阅