单分子水平上的可视化翻译

由玛丽传动装置

调节翻译是细胞功能的关键,特别是在发育或应激期间。通过核糖体分析,研究人员已经能够研究各种刺激对全局翻译的影响,但视觉技术研究翻译仍然是难以捉摸的。两种技术Addgene储户通过两种不同的方式更容易跟踪翻译:通过监测第一轮翻译或通过长期跟踪单个mRNA的翻译。它们都在帮助研究人员探索细胞生理学中翻译控制的复杂性。

核糖体剖析

核糖体分析是2009年发展起来的一种生化方法,它对细胞中所有mRNA结合的核糖体进行“快照”。当细胞mRNA被核糖核酸酶消化时,核糖体保护它们所结合的mRNA片段。这些区域随后被测序,并与基因组对齐,以确定全基因组翻译频率。虽然这种技术非常有用,但它需要大量的样本处理以避免破坏核糖体- mrna复合体。最近的工作已经采用这种技术来监测局部翻译,并确定蛋白质是否靶向到他们的目的地共或翻译后。

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技巧:将第一轮翻译可视化

而核糖体分析选择核糖体的物理位置,TRICK (TranslatingRNA法师的C燕麦的蛋白质K而不是利用核糖体的运动。当核糖体沿着mRNA移动时,它会取代其他rna结合蛋白,从而实现转译。对于TRICK报告基因mRNA,这种置换导致荧光信号的变化:未翻译的rna呈现黄色,翻译的rna呈现红色。要启用这种颜色切换,TRICK需要以下组件:

  1. 一种通过PP7外壳蛋白与报告基因mRNA的编码区结合的GFP蛋白(NLS-PCP-GFP)
  2. 一种RFP蛋白,通过MS2外壳蛋白与报告基因mRNA的3 ' UTR结合(NLS-MS2-RFP)
  3. 报告基因mRNA,包含荧光蛋白的系结位点,并由一个可诱导启动子(质粒)驱动伟德2021足球欧洲杯买球平台6454264543)

在翻译之前,GFP和RFP都绑定到报告者上,导致报告者呈现黄色。翻译过程将NLS-PCP-GFP从mRNA中剥离,只留下一个红色FP与报告基因结合。因为它包含一个核定位信号,NLS-PCP-GFP然后返回细胞核与同源的非翻译mrna结合。该系统的高特异性和分辨率是通过使用PP7和MS2外套蛋白结合位点的多个副本将许多fp外套蛋白融合物的副本系结到它们的报告mrna上而实现的。使用转译抑制剂环己胺和嘌呤霉素,Halstead et al。验证翻译对于从TRICK报告中删除GFP是必要的。

诀窍记者延迟翻译在果蝇发育中起着重要的作用,Halstead等人利用TRICK研究了果蝇模式基因的翻译奥斯卡·。在发展的早期,商船,TRICK记者被贴上了双重标签,表明存在翻译抑制。在后期阶段,单一rfp标记商船后极检测Oskar蛋白。Oskar蛋白水平与GFP强度呈负相关,表明TRICK是相对报告翻译的准确解读。

单分子连续翻译跟踪

TRICK允许你看到第一轮翻译,但它不允许继续跟踪给定的mRNA,因为NLS-PCP-GFP被翻译mRNA的第一个核糖体移除。为了长期追踪,燕等。设计了一种标记mrna和它们对应的新合成蛋白质的系统。在TRICK系统中,报告基因mRNA的3 ' UTR被PCP-mCherry标记(图2)。3 ' UTR还包含一个CAAX序列,用于将mRNA结合到质膜上;这个序列阻止了mCherry标记的mRNA的扩散,并将其保持在一个单一视野中,以便持续跟踪。然后你就可以直接监控这个mRNA的多轮转译;你可以看到单分子水平上的平移动力学。

Yan等人报告的编码序列包含24个SunTag拷贝,这是一种合成支架,可以招募融合到SunTag特异性抗体scFv的GFP。每次报告基因被翻译,新生多肽上的SunTag位点招募scFV-GFP,产生与红色报告基因mRNA共定位的绿色斑点。Yan等使用三尖杉酯碱(一种翻译抑制剂,在起始后阻止核糖体)计算核糖体易位率为~3.5个密码子/秒。他们还研究了5 ' UTR变异对细胞周期蛋白Emi1翻译的影响,发现约80%的长5 ' UTR转录本翻译沉默。

随着时间的推移跟踪翻译

这两种方法都增加了我们对翻译动态的理解,但它们也有一些需要注意的地方。在这两种情况下,生成报告基因mRNA都需要在编码序列和3 ' UTR中插入多个发夹序列。在开始实验之前,重要的是要验证这些变化不会像这些论文的作者那样影响翻译率。由于基于suntag的系统将mrna绑在质膜上,因此不适用于通常在特定隔间翻译的mrna。尽管有这些限制,这些技术为研究各种细胞类型和生理状态的翻译提供了强大的工具。


参考文献

1.Ingolia, Nicholas T.,等人,“使用核糖体分析的核苷酸解析翻译的体内全基因组分析。”科学324(5924)(2009): 218 - 23所示。PMID: 19213877PMCID: PMC2746483

2.Halstead, James M,等译。一种RNA生物传感器,用于从单细胞到活体动物的第一轮转译成像。”科学347(6228)(2015): 1367 - 71。PMID: 25792328PMCID: PMC4451088

3.“单mRNA分子在体内翻译的动态”闫晓伟等。细胞165(4)(2016): 976 - 89。PMID: 27153498PMCID: PMC4889334

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