什么是洗脱和储存质粒DNA的最佳方式?

由Paolo Colombi.

Paolo Colombi.

如果您使用试剂盒进行DNA净化或使用DIY净化协议,您可能已经注意到有许多选项可以洗脱您的DNA准备。您可能会看到建议在水中洗脱的协议,TRIS-EDTA(TE),只是TRIS缓冲区或其他一些变体。这有什么不同吗?简短的答案:是的。最后一步将影响样本随时间的稳定性,并确定您可以有效使用DNA的实验。

pH和DNase会影响DNA稳定性

实验室中的一个addgenie在实验室外套和掩码中握住tris缓冲液,另一方面
图1:如此多的选择!要做什么吗?

影响DNA在溶液中的稳定性的主要因素是pH值和DNase污染。

极端pH可以变性,断裂,甚至改变DNA序列。高pH有利于氢键的破裂,稳定地稳定分子并有利于两个螺旋的分离。低pH改变导致负责DNA螺旋糖骨架的酯键的破裂,或者甚至通过所谓的机制改变DNA序列疏皮。在去嘌呤过程中,糖苷键的水解导致DNA中释放出嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)。如果在双链DNA中,这些无嘌呤位点可以通过碱基切除修复进行修复,但在复制过程中可能导致单链DNA发生突变。

另一方面,DNA酶可以消化降解双螺旋、分裂质粒DNA、PCR产物或染色体。质粒DNA提取纯化过程中降解的主要原因之一大肠杆菌是由基因编码的蛋白质内切核酸酶的存在恩达。如今,最多常见的大肠杆菌菌株用于质粒扩增是恩达阴性,意味着基因被移除/突变以中和核酸酶活性。对于仍然携带该基因的菌株,通常有额外的步骤,如热失活、蛋白质降解和/或使用螯合剂,可以在纯化方案中引入,以去除内切酶活性。

由于这些原因,选择正确的解决方案是基本的,它将影响您能够在不具有实质性退化的情况下存储样本的时间,并且您可以使用质粒的实验。

DNA洗脱选择:TE, Tris缓冲液或水

三瓶紫色盖子连续。瓶子标有Tris-EDTA,TRIS和DH2O。
图2:TRIS-EDTA,TRIS或水?您选择的缓冲区可能会影响您的下游实验。

TE (10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA, pH 8.0)缓冲液是长期保持制剂稳定性的最佳缓冲液。Tris缓冲液控制pH值,而EDTA螯合任何二价阳离子,如Mg2+,阻止DNase的活性。虽然这对于保持DNA的稳定性非常重要,但它会限制你对这些样本所能做的事情。这是因为二价阳离子是现代分子生物学中使用的许多工具(如限制性内切酶和聚合酶)的必要辅助因子。当你需要在TE中使用质粒进行任何酶促反应时,一个有效的可能性是在水中稀释你的样品以降低EDTA浓度。

或者,如果优先级直接在涉及酶反应的任何下游施用中使用DNA制剂,则有效的替代方案可以是TRIS缓冲液(没有EDTA)或水。这些是公司通过其套件提炼质粒DNA的两种选择。使用TRIS缓冲液的优点是它可以更好地控制稳定质粒的pH制剂,并且仍然允许大部分下游加工。另一方面,核酸酶是一种很好的选择,因为它为如何在每种类型的实验中使用质粒提供了极大的多功能性。两种解决方案可能在其延长时间内储存期间保持DNA稳定性的能力不同,特别是在室温或4℃下。

存储DNA:温度和寿命

当你刷你的DNA时,你应该考虑一些更多的东西:你打算储存它以及多长时间。最常见的解决方案是将质粒保持在-20℃或甚至在-80℃下,在这种情况下,可以在水中洗脱或在偏好的缓冲液中洗脱,并且多年来它将是稳定的。质粒DNA可以稳定短时间内保持4°C甚至室温,有迹象表明在这些条件下,TRIS缓冲液比水更好

下次你准备质粒的时候,在你把洗脱缓冲液滴到你的DNA上之前,详细计划一下。知道如何使用质粒DNA可以帮助你选择最好的方式来存储和洗脱DNA。

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参考文献

Murakami M(2013)评估DNA质粒储存条件。公开生物技术杂志7:10-14。https://doi.org/10.2174/1874070701307010010

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