伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白101:绿色荧光蛋白让你失望的时候

客人的博客

本文由客座博客Joachim Goedart撰稿,Joachim Goedart是阿姆斯特丹大学分子细胞学和先进显微技术van Leeuwenhoek中心的助理教授。

GFP.是最流行,最广泛使用的基因编码荧光探针。有几个因素导致了GFP包括(i)快速的普及和完整的成熟功能,荧光蛋白在几乎所有生物体和细胞类型,(2)不需要添加辅助因子,(iii)简单的可视化标准过滤器设置在荧光显微镜,最后在融合蛋白(iv)良好的宽容。

由于GFP是一种经过充分验证、性能优良的探针,因此在选择基因编码荧光标记时,它是首选。但是,如果您选择使用它,可能会遇到一些限制。下面将讨论这些限制和可能的解决方案。

有许多GFP变体。在这里,我使用名称'GFP',这是指MEGFP。通过在原始的水母GFP(AVGFP)中引入两个突变(F64L,S65T)来制造该变体,以产生增强的GFP(EGFP),这是一种改善亮度的变体(钱,1998)。另一个突变(A206K)需要产生严格单体的EGFP变异,mEGFP (Zacharias等人,2002年)。

GFP需要氧气

发色团的形成需要一个完全折叠的β -桶结构,然后通过分子内反应生成发色团(Tsien, 1998)。重要的是,该反应需要分子氧,因此,GFP在厌氧条件下仍不荧光。这适用于任何AvGFP和珊瑚衍生的荧光蛋白。伟德2021足球欧洲杯买球平台因此,GFP不适合需要厌氧条件的应用。

在需要厌氧条件的实验中,可以使用结合内源性荧光辅助因子的蛋白质。例如结合黄素的LOV结构域(巴克利等人。,2015年)或结合胆红素的Unag蛋白(Kumagai 2013)。在这些自然发生的辅助因子结合蛋白旁边,已经设计了蛋白质结合合成的荧光类似物的系统(刺,2017)。这些荧光类似物通常被添加到浴溶液中并需要通过细胞吸收。需要在逐案的基础上审查厌氧条件下的特定生物系统中哪种策略最适合。

GFP对酸敏感

GFP的发色团可以以质子态和去质子态存在(Tsien, 1998)。脱质子态的吸光度最大值约为488 nm,其发光峰值为508 nm。然而,质子态不吸收488纳米处的光。这两种状态之间的比率反映在pKa上,GFP约为6.0。这个数字表明,在pH值为6时,仅有50%的可用绿色荧光蛋白发光。伟德2021足球欧洲杯买球平台

的pKa伟德2021足球欧洲杯买球平台可以准确确定体外通过测量不同酸浓度下纯化蛋白的荧光强度。提供不同荧光蛋白的PKA值的概述(Cranfill等人。,2016年FPbase.org)。许多变体在酸性条件下仍具有荧光,pKa值低于4。例如mTurquoise2 (pKa = 3.1), tagRFP (pKa = 3.1)和mCherry (pKa = 3.8)。我们观察到mCherry(和mTurquoise2,未显示)在酸性细胞器(图1),表明其耐酸能力在细胞内得以维持。

抗酸荧光蛋白在溶酶体中仍具有荧伟德2021足球欧洲杯买球平台光

GFP是大

GFP是一种28kda的蛋白质,它类似于一个长4.2 nm,直径约2.4 nm的圆柱体(Hink等人。,2000)。完整的贝塔桶对于它的荧光是必要的,因此不能通过删除残基来缩小GFP。只有大约10个氨基酸可以从c端删除,大约5个氨基酸可以从n端删除,但这并不能减少它的大小。GFP的巨大尺寸可能会干扰融合蛋白的活性或定位。此外,在目标蛋白相对较小的情况下,添加GFP可能会改变扩散速率。

较小的基因编码探针是基于如上所述的辅助因子结合蛋白。最小的标签是肽,它们被设计成与荧光团具有高亲和力的特异性结合。的例子是闪存标记他的标签和其他一些。另一种基于肽的策略是使用一种酶用荧光团共价标记肽。这两个系统都是基因编码的标签和外部添加的组件的混合体。查看回顾Lotze等人(2016)。到目前为止,完全由基因编码的小探针还不存在,但开发非天然荧光氨基酸并将其并入蛋白质是朝着这个方向迈出的一步(Chatterjee等人,2013;Hilaire等人,2017)。

GFP只能用于标记蛋白质

通过将其DNA码连接到另一种蛋白质的cDNA来制备GFP融合蛋白。有效地,它配备了对可以报告位置的额外蛋白质模块的蛋白质。这种方法能够研究细胞中的蛋白质,但不是其他感兴趣的生物分子。DNA,RNA和脂质。仍然,通过使用特异性结合感兴趣分子的蛋白质结构域可以间接地可视化这些分子。例如,Pleckstrin同源结构域可用于检测特定的磷酸钠(Varnai和Balla, 2008) (图2)

通过使用特异性检测特定RNA阀杆环结构的MS2涂层蛋白可以检测RNA产生(Querido和Chartrand, 2008)。最后,核酸酶缺陷的CAS9可以在由GRNA定义的基因组中结合基因组。由于CAS9是蛋白质,因此具有GFP的融合允许检测基因组位置(Chen等人,2013)。

GFP融合脂质结合域磷酸肌醇

GFP荧光与自发荧光重叠

用来激发绿色荧光蛋白的青色光,也可能激发细胞或培养基中自然存在的几种成分。这些“自身荧光”的来源包括培养基中的核黄素或哺乳动物细胞中含有蛋白质的黄素。一般来说,当激发波长变为更长的波长时,自发荧光就不是什么问题了。因此,使用鲜红色荧光蛋白(如mScarlet)或红外荧光蛋白(伟德2021足球欧洲杯买球平台Chernov等人。,2017年)可以改善检测。由于较长的波长具有更好的组织渗透,(红外)红色荧光蛋白也是更稠的样品的更好选择。伟德2021足球欧洲杯买球平台

另一种避免自身荧光的方法是生物发光蛋白。这些探针通过化学反应产生光,因此,没有必要激发样本。虽然生物荧光探针通常比荧光探针昏暗,但最近的工程努力增加了这些基因编码的光发射器的亮度。Takai 2015Iwano等人,2018)。

GFP在我的融合中不容忍

它是标准的做法,将GFP连接到另一种蛋白质的N-或C-末端。然而,这可能干扰蛋白质的功能。当蛋白质与脂肪酰基链进行翻译后修饰时,这显然是这种情况。例如,MyRistoylation需要N末端共有序列(Mg-),并且戊酰化需要C末端共有序列(-CAAX)。当GFP与这些序列融合时,这两个修改都被破坏。

当不可容忍N-和C末端融合时,替代方案是将GFP插入到感兴趣蛋白质的编码序列中。这效果很好的原因之一是GFP本身的N-和C-末端相对较近,从而最小化靶蛋白的破坏。通过这种方式,我们(和其他)已经成功地生成了不容忍N-和C末端融合的几个功能异质型G-α子单元融合(Adjobo-Hermans,2011年)。结构信息有助于选择合适的位置,尽管产生几个变体和检查融合的功能仍然是值得的(Mastop 2018)。

总结

GFP是一种全面有效的基因编码探针,但也有其局限性。意识到这些限制对于成功使用GFP或任何其他荧光蛋白伟德2021足球欧洲杯买球平台。幸运的是,许多限制通常都有解决方案,而随着全球众多科学家不断努力所产生的不断扩大的基因工具箱,绿色fp的替代品的数量预计将会增长。


非常感谢我们的客座博主Joachim Goedhart!

Joachim_100pxJoachim Goedhart是分子细胞学和Van的助理教授Leeuwenhoek高级显微镜中心(阿姆斯特丹大学)。他开发,表征,并使用遗传编码的荧光探针。你可以在推特上关注他:@joachimgoedhart

参考文献

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