什么时候单体不是单体?你最喜欢的荧光蛋白在细胞中齐聚的三种方式

客人的博客

GFP multimerization

这篇文章是由Guest Blogger提供的贡献埃里克·l·Snapp

停止使用EGFP/GFP来融合蛋白质!尽管有很多高质量的期刊文章,许多研究者仍然不知道EGFP/GFP易于形成非共价二聚体。EGFP的这种特性可能导致重要的人工制品。

如果您正在使用绿色荧光蛋白或增强绿色荧光蛋白(GFP/EGFP)作为转录报告因子或作为细胞的一般细胞质标记,没有问题。你是好的。然而,如果你将感兴趣蛋白(POI)与GFP融合来研究蛋白质在细胞中、溶液中或介于两者之间的行为,那么你使用的标签就有一个严重的缺陷。标准的EGFP质粒,曾经由Clontech出售,现在在世界上几乎每个实验室的冷冻箱里,并不是惰性的。严肃地说,EGFP/GFP确实具有非共价二聚的非平凡倾向。这意味着你的POI与GFP或其他荧光蛋白(FP)融合在细胞中形成二聚体。你为什么要关心这个?下面列出了三种简单的方式,二聚FP可能会毁掉你的一天(和实验)。避免这些常见问题的解决方案如下。

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这是一个浓度问题

自然界中的大多数FPs都容易发生二聚(即EGFP) [1,2,甚至形成专性四聚体(即DsRed) [3.]。这是融合蛋白的问题。FPS的主要应用是可视化POI的本地化,动态和行为。作为调查员,您希望将融合标签惰性,不要在实验中产生伪影。相当大的努力已经进入了FPS单体,但许多调查人员仍然无知的FP二聚体。同样有问题的是,报道的几种单体FPS实际上不是单体,至少在实际术语中。特定类型的分子形成二聚体的倾向取决于其分子亲和力,称为解离常数或Kd,它的浓度。较小的Kd,特定类型的分子相互作用的可能性就越大。一种含有纳摩尔的蛋白质Kd当蛋白质具有高微摩尔或低毫摩尔时,主要以二聚体的形式存在于细胞中吗Kd不太可能在细胞内形成二聚体。的Kd为0.11 mM [2]。按照上面列出的简单逻辑,你可能认为EGFP不可能在细胞中形成二聚体。不幸的是,事情没有那么简单。

浓度是体积内的分子数。在许多生物学研究情况中,相关体积是细胞的。对于与分子浓度相关的物理行为进行精确预测,假设分子在整个体积中均匀分布,并且可以在720°中自由地翻滚。However, if the molecules are confined to a subregion of the cell and/or they cannot tumble in 720°, i.e. they are on a membrane or in an organelle, then their effective concentration will be much higher than if they are homogenously distributed and mobile throughout the cell. If two copies of a molecule are part of a single fusion protein, as in a而生物传感器然后围绕该融合蛋白的局部浓度的FPS非常高。下面描述这些细胞中这些情况的实际实例(见图1)。

GFP二聚可能引起的问题

1.跨膜荧光蛋白融合

跨膜蛋白,即受体和转运蛋白,集成到脂质双层中。FP对跨膜蛋白的融合显着增加了FP的有效浓度。FP被限制在平面上,通常仅在360°中旋转,增加两个FPS将彼此碰撞的概率。后果可能是戏剧性的。对于定位于内质网的膜POI,小管的类似蜘蛛网样图案可以严重变形成致密堆叠膜,如果将FP与POI融合,则掺杂有组织的光滑的内质网或OSER。这些结构大(微米),明亮,非生物,难以忽视[1,2]。

2.融合到迫使少量或低聚物

一些细胞蛋白质通常会自我结合成同型二聚体或更高阶的低聚体。不幸的是,FP二聚结合POI二聚会导致融合蛋白聚合。随着融合蛋白浓度的增加,二聚体融合蛋白将有两个FP结合域形成足以形成聚合物的构建块。由此形成的聚合融合蛋白往往定位不正确,可能功能不正常。

3.与FRET生物传感器结合

一个而生物传感器是一种通过构象变化使单个蛋白质上的两个FPs靠得更近或更远的报道。距离的变化会改变一个荧光蛋白向第二个荧光蛋白非辐射转移能量的能力,通常会降低第一个荧光蛋白发出的荧光信号,而增加第二个荧光蛋白发出的荧光信号。一些早期的FRET生物传感器是用CFP和YFP制成的,其中青色和黄色的EGFP也能像EGFP一样二聚。因此,CFP和YFP二聚体可以在没有环境变化的情况下形成,生物传感器旨在检测导致假阳性[2,4]。

解决聚合物问题的方法

有一些简单的解决方案可供研究人员处理所有这些问题。最简单也是最好的解决方案是使用真正的单体FPs。EGFP和其他GFP家族成员(superfolder, Emerald, CFP, YFP, BFP, Cerulean, Turquoise, Venus,和Citrine)可以用A206K突变单体[2]。Addgene有很多这些构造它们被指定为mGFP, mVenus等。需要注意的是,因为非GFP衍生的FPs(即红色FPs)不一定是单体的,即使它们在出版物中被描述为单体。测定蛋白质是否单体的金标准是沉淀平衡分析超离心法[2]。一些描述上述FPs的论文中使用的亲和分析,包括分子浆液柱和天然凝胶,未能检测到EGFP二聚。重要的是,所有这些测定都进行了在体外。FP二聚体检测方法在活的有机体内细胞环境,如CytERM螺旋形成试验,是二聚电位的实际测量方法,它将决定FP在实验相关环境中是否会二聚。有关更详细的讨论,请参阅[5]。

问题1和2取决于蛋白质浓度。不完美的解决方案是将成像分析限制对表达融合蛋白的最低水平的细胞。这可以减轻诸如EGFP的中等诸如EGFP的FPS的伪像,但不适用于例如DSRED或高亲和力FPS,例如TAGRFP。在大多数情况下,可以通过使用来自不同家族的单体FPS或FPS来解决问题3,其不能形成异二聚体(即EGFP和MCHERRY)。这些简单的策略可以帮助您为您的学习做出更好的荧光融合蛋白记者,并大大降低找到艺术成果的机会。


非常感谢我们的客座博主Erik L. Snapp!

埃里克·L SnappErik Lee Snapp在俄勒冈州卫生科学大学的分子微生物学和免疫学中获得了他的博士学位,他的博士后奖学金与詹妮弗·莱宾·施瓦茨(Jennifer Lippincott-Schwartz)是国家卫生研究院,他目前是Albert Einstein医学院副教授在解剖学系和结构生物学。他的兴趣包括内质网和活细胞成像方法中分泌蛋白质的质量控制。Erik也是狂热的长途跑步者,加德纳和厨师。

参考文献

1.Snapp, e.l.等人,通过低亲和力蛋白质相互作用形成堆叠的ER CISTernae。细胞生物学杂志,2003。163(2):p。257-69。PubMedPMID:14581454。公共医学中心PMCID:PMC2173526

2. Zacharias,D.A.等人,将脂质改性的单体GFP分配成活细胞膜微粒子。科学,2002年。296(5569): 913 - 6页。PubMedPMID:11988576

3.Matz, m.v.等人,伟德2021足球欧洲杯买球平台来自非双硫化的荧光蛋白,非双硫化的AnthozoA物种。Nat Biotechnol,1999。17(10): 969 - 73页。PubMedPMID:10504696.

4.Ohashi, T.等人,基于gf的FRET实验研究,应用于本质上非结构的蛋白质。蛋白质SCI,2007年。16(7):p。1429-38。PubMedPMID: 17586775。公共医学中心PMCID: PMC2206698

5. Costantini,L.M.等。,评估荧光蛋白在生理条件下齐聚的趋势。伟德2021足球欧洲杯买球平台交通,2012年。13(5):p。643-9。PubMedPMID: 22289035。公共医学中心PMCID: PMC3324619

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