CRISPR 101:我选择哪个CAS9为我的CRISPR实验选择?

由Joel McDade.

思考不同Cas9变体的人

注意:这篇博文,选择CRISPR核酸酶:网站可访问性,特异性和敏感性,包含其他CAS蛋白质选项(2019年11月发布)。

CRISPR/Cas9的出现使人们比以往任何时候都更容易有效地进行精确、靶向的基因组修饰。Cas9已经经过改造,使研究人员能够昏死激活、抑制甚至图像你最喜欢的基因。但是,通过可用的基于Cas9的类别的类别可用,您如何选择您选择哪种Cas9对您的特定实验是正确的?此博客帖子将帮助您熟悉通过Addgene的存储库可用的广泛的CAS9,并且可以轻松选择适合您的Cas9试剂。

在任何CRISPR实验中要做的第一件事就是确定你到底想要做什么。你是想永久地敲除某个细胞或生物体中的某个基因吗?你是否试图在不永久修改基因组的情况下减少某一特定基因的表达?尝试在一个特定的位点激活是否更有意义?在特定位置修改表观基因组怎么样?如您所料,这个问题的答案将在很大程度上影响您的实验需要哪一个Cas9的决定。下面是使用Cas9可以进行的一些常见基因操作的简要总结,以及每种操作都可以使用的特定Cas9s。

为你的淘汰实验选择一辆Cas9

CRISPR淘汰一代代使用标准SpCas9进行基因敲除

通过将特异于基因的GRNA与待靶向的GRNA和内切核酸酶CAS9共表达敲除细胞或动物。基因组靶可以是任何〜20个核苷酸DNA序列,只要它达到两个条件:1)与基因组的其余部分相比,序列是独特的。2)目标立即存在于相邻主题(PAM)的原子晶圆的上游。SPCAS9是有一个合适的靶位网站的常见选择,并且对于偏离目标效果很少关注(例如,在整个基因组中具有最小的同源位点的最佳GRNA设计)。addgene携带各种各样的SPCAS9含有质粒已经优化用于在细菌,酵母,蠕虫,果蝇和哺乳动物中进行基因组工程实验。

特异性的担忧?考虑使用高特异性Cas9变体。

通过适当设计GRNA序列,可以提高CAS9介导的乳化的特异性。也就是说,选择在基因组中其他地方具有最小同源性的目标序列。已经使用各种方法来进一步增强Cas9特异性。例如,Cas9-Nickase(Cas9n)利用Cas9通过两个核酸酶结构域RuvC和HNH结合的活性产生双链断裂(DSBs)这一事实。将两个关键的酶残基中的一个转化为丙氨酸(D10A或H840A)会生成不能产生双链断裂的“裂口”Cas9。因此,需要两个合适的靶向Cas9n分子在靶位点高效地创建dsb,这与野生型SpCas9相比大大提高了特异性。

虽然Cas9n肯定比野生型SPCAS9更具特异性,但是当只有一个GRNA用CAS9N表示一个GRNA时,DSB仍然可在靶位点处检测到。这意味着Cas9n可以绑定并导致其一个GRNA中的一个偏离目标站点的indel。可以通过使用与非特异性内切核酸酶Foki融合的核酸酶死Cas9(DCAS9)来克服这种限制。Foki仅在二聚时切割靶DNA。所以,dcas9-foki.在发生任何切割之前,基本上需要适当地靶向靶位点的两个DCAS9-Foki分子;DCAS9-Foki不太可能切断单个GRNA指定的偏离目标而不是CAS9N。

CAS9N或DCAS9-FOKI方法对CAS9N或DCAS9-FOKI方法的明显限制是它们都需要在近距离接近的两个合适的目标序列,以便有效地产生DSB。在MGH的广泛研究所和Keith Joung的小组包括冯Zang的实验室,包括冯章的实验室,已经使用了结构生物学来识别Cas9 Cas9切割偏离目标网站的关键残留物。所谓的“增强Cas9”(张)或“高保真CAS9”(Joung)对目标基因座的野生型SPCAS9具有可比性的切割活动,但大大降低了偏移的偏移活动。这些CAS9变体增强了特异性,而不需要目标基因座内的两个或更多个相邻的靶位点。有关增强特异性CAS9变体的更多信息可以找到在我们题为“使用ESPCAS9和SPCAS9-HF1增强CRISPR靶向特异性

当存在没有5'NGG'3 PAM序列时,我该怎么办?

  • 具有新型PAM识别的合成卡斯9

通过细菌中的一系列阳性选择筛选,Keith Joung团队发现化脓性链球菌Cas9突变体(VQR、EQR和VRER Cas9变种)识别新型非NGG PAM序列。重要的是,VQR,EQR和VRER CAS9变体能够改变不能使用野生型SPCAS9进行修饰的基因组基因座,并且它们对PAM变体的特异性类似于人类细胞中几种基因组靶标的野生型SPCAS9。包括VQR,EQR和VRER SPCAS9变体有效地加倍人类基因组内CRISPR / CAS9的靶向范围。有关通过Addgene可用的各种合成CAS9的更多信息,可以在我们的博客帖子上找到“PAM要求和扩展SPCAS9之外的CRISPR

  • 非S. pyogenes cas9s

额外的Cas9同源物已从各种细菌种类中分离出来,并且许多与典型的NGG PAM序列以外的许多结合PAM序列。因此,由于PAM序列以外的原因,所谓的“非SP”CAS9可能更适合您的实验。例如,Cas9的编码序列来自金黄色葡萄球菌(SACAS9)它比SpCas9小约1千碱基,可以被包装成腺相关病毒(AAV),这是目前基因治疗的金标准。重要的是要记住,非spcas9只与来自同一物种的tracrRNA和crRNA(或合成gRNA)兼容。关于Addgene提供的各种非spcas9的更多信息可以在我们的博客文章中找到“PAM要求和扩展SPCAS9之外的CRISPR

  • 非CAS9 CRISPR内切核酸酶,CPF1

注意:CPF1也称为CAS12A。

Cpf1是一种单rna引导的核酸切酶最近由广泛研究所的Zhang Lab确定了一个新的Crisp indoNuclease。这个非Cas9 Crisprp内切核酸酶,称为Cpf1,是2类CRISPR内切核酸酶,其能够以RNA依赖性方式切割靶DNA。是什么让cpf1如此有趣不是与cas9的相似之处(它有很多)但差异。CPF1的PAM序列是5'TTN 3',位于目标站点(与目标站点3'的CAS9 PAM相反)。内切核酸酶含有类似于Cas9(D917和E1006)的两个酶残留物,但两个残基位于Ruvc结构域(CPF1缺少HNH结构域),并且残留物的突变完全消除了DNA裂解。与SPCAS9相反,通过突变单一酶残留物可以转化为酸氨酸酶。有趣的,CPF1切割导致来自PAM序列的5个核苷酸5'覆盖18碱基对。这与Cas9切割不同,导致钝的DNA结束3底对对PAM序列的底座。CPF1的交错切割模式是允许研究人员避免使用低效的HDR依赖性途径对于基因编辑,仍有待证明,无论如何,CPF1的最令人兴奋的应用可能尚未到来。您可以找到CPF1质粒并链接到出版物Addgene网站并读一点关于我T.在我们的博客上

上述大多数CAS9变体已被用于产生通过的特定基因编辑同源性定向修复(HDR)路径。看我们CRISPR指南有关如何使用CRISPR生成特定基因编辑的更多信息的页面。

CAS9的激活和抑制靶基因

Cas9的一个独特方面是其能够独立于其能力结合靶DNA劈开靶DNA。换句话说,Cas9包含破坏DNA裂解(D10a和H840a的SPCAS9)的Cas9仍然能够结合靶DNA。此外,所谓的核酸酶死Cas9或“DCAS9”可以用作通过将它们直接熔化到DCAS9来将各种货物传送到特定DNA基因座的平台。DCAS9的这种性质已被利用以使各种蛋白质阵列定位为靶向基因,包括转录激活剂和转录压缩机。

使用基于DCAS9的阻遏物压制靶基因

使用DCAS9的早期实验在细菌中发现,将dCas9定位于转录起始位点足以通过阻断转录起始来“抑制”或“敲掉”转录。在哺乳动物细胞中,强大的抑制需要将标记有转录抑制因子的dCas9靶向到相关基因的启动子区域。当敲除你的目标基因对细胞有毒时,你可能想要考虑使用包括dCas9-KRAB在内的基于dcas9的抑制因子。质粒可以在多种物种和细胞类型中抑制靶基因Addgene的网站

使用基于DCAS9的活化剂激活靶基因

基于dcas9的激活器的阵列非常多样。最简单的激活因子由dCas9融合到单个转录激活域(通常是VP64)组成。第二代激活剂最近已经开发出来,这些激活剂通过几种不同的方法改变基因表达。例如,“suntag”系统通过表位标记的dCas9和抗体激活物融合蛋白的共表达,可以方便地将多个激活域招募到同一个基因位点。的协同激活中介复合物由DCAS9-VP64融合和改性GRNA组成,其能够与附加的RNA结合转录活化剂相互作用。可以找到用于激活各种物种和细胞类型中的靶基因的另外的质粒Addgene的网站

好的,我选择了一个Cas9!我接下来怎么办?

您已选择适合您实验的CAS9。下一步你要怎么做?以下是一些考虑因素,可以帮助您向前移动您的CRISPR实验。

设计或选择一个gRNA - Addgene可能已经携带a“验证GRNA”对于你最喜欢的物种中最喜欢的基因。经过验证的GRNA已成功用于实验中,并在同行评审期刊上发布,并在启动CRISPR实验时挽救您的实验时间和金钱。如果您需要为您的实验生成新GRNA,您可以选择各种各样的“空gRNA向量”并设计你的gRNA靶向序列使用许多免费的gRNA设计程序

我应该使用什么样的表达系统或表达方法?为你的实验选择合适的Cas9试剂只是战斗的一半-现在你必须选择合适的表达系统,并将Cas9交付给你的目标细胞!Addgene携带多种Cas9质粒,这些质粒已被优化在不同物种和细胞类型中表达,包括(但不限于)细菌、酵母、植物、果蝇、蠕虫和哺乳动物(通过模式生物浏览质粒,在这里)。对于难以转染的细胞类型,你可能想要考虑使用慢病毒将Cas9传递到你的目标细胞。更多关于哺乳动物细胞的各种传递系统的信息可以在我们的博客中找到,“CRISPR 101:哺乳动物表达系统和交付方法”

验证您的Genome编辑 - 一旦您将CAS9和GRNA交付给目标单元格,就是时候确认您的目标序列已被修改!确切的协议可能因您的特定实验而异,但可以在我们的博客文章中找到您可以在博彩帖子中找到的各种方式的广泛概述“CRISPR 101:验证你的基因组编辑”

为你的下一次CRISPR实验找到验证过的gRNAs


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