我应该使用哪种荧光蛋白?

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伟德2021足球欧洲杯买球平台荧光蛋白(FPs)首次被发现是在50多年前,绿色荧光蛋白(GFP)的发现,一种来自水母Aequorea Victoria的蛋白质。因为这个发现,FPs家族不断扩大,有上百种变体可供选择。继续阅读以熟悉可用的FP发射颜色,并在为你即将进行的实验选择一种(或两种)FP时记住10点。

荧光是一种吸收了光的物质发出的光。发出的光的波长比激发波长长。因此,FPs是具有这种独特能力的蛋白质。

许多FPs在大多数生物中异位表达时是荧光的。此外,FPs与另一种蛋白质融合通常不会影响其荧光。因此,FPs被用来研究许多生物学问题。两种最常见的用法是:1)测试特定系统中的表达水平(通过测量荧光强度);2)以可视化FP的定位(融合到感兴趣的蛋白质),从而跟踪在活细胞内部的该生物分子的定位。

按发射颜色分类的帧数(发射波长范围)

FPs通常按下列发射颜色分类(或发射波长范围)。通过变异GFP蓝色的《外交政策》(桶)青色《外交政策》(CFP),和黄色的《外交政策》(YFP)。对于绿色荧光蛋白的分解,它的变异,和它们相关的突变,检查一下Marcy上周关于GFP的文章。另外,在其他生物中发现了许多其他FPS。

蓝色的 424 - 467 nm
青色 474 - 492纳米
绿色 499 - 519 nm
黄色的 524 - 538纳米
橙色 559 - 572纳米
红色的 574 - 610nm
红光对于 625 - 659纳米
红外线 ≥670nm.

除了发射波长范围外,在选择FP时还需要考虑其他特性:

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  • Photoactivatable / Photoconvertible:通过特定激发波长激活,这些蛋白质可以在激活时切换颜色。这意味着发射波长可以改变。在少数情况下,蛋白质的初始状态是非荧光的,因此允许非常低的荧光背景水平。这样的例子可光激活或可光电蛋白质分别是PA-GFP、Dendra2和mEOS蛋白。有些蛋白质是可逆的(如rsEGFP, Dreiklang)。

  • 荧光计时器(英尺)这些蛋白质随着时间的推移会改变它们的颜色。因此,这些可以是用作蜂窝进程的“计时器”后激活。四种主要的ft分别是Slow-FT、Medium-FT、Fast-FT和mK-GO。

  • 大斯托克斯位移(LSS): Stokes shift(以…命名乔治·g·斯托克斯)是从激发到发射的波长的变化。对于大多数FPS而言,Stokes Shift小于50nm(通常更少)。对于LSS蛋白,Stokes Shift≥100nm。具体地,这些蛋白质通过UV光或蓝光激发,它们的发射是绿色或红光。例如,T-Sapphire, LSSmOrange和LSSmKate

  • 荧光传感器:这些FPs会随着环境的变化而改变其激发/发射行为(例如pH值,Ca2 +通量等)。最常用的是GECIs——基因编码的钙指示剂(例如GCaMP)。其他包括:pHluorin & pHTomato (pH传感器),HyPer (H2O2传感器),ArcLight(电压传感器),iGluSnFr(谷氨酸传感器)。更多的例子生物传感器可以在Addgene上找到
  • 拆分fps.一些FPs(例如GFP, Venus)可以被分成两部分,它们本身是不发光的。如果两半在很近的距离,它们将形成完整的FP并发出荧光。分裂的FP可以用来确定两个蛋白质融合到分裂FP的一半的接近程度。这种技术也被称为双分子荧光互补(BIFC)Fluorescent_Proteins_Cell_Imaging

选择荧光蛋白时要记住8点

  1. 激发和发射(ex/em):
    • 每个FP都有其独特的ex/em峰。因此,选择你的系统可以激发的FPs,并检测发射。例如,如果你的显微镜只有两个激光器,488nm和561nm,你将不能使用远红色fps。如果你没有滤光片,将蓝光传递给探测器/相机,那么bfp对你来说就没有用了。

    • 当使用多个FP时,确保它们的发射光在波长上不重叠。在许多显微镜中,滤光片不够窄,无法分辨密切相关的颜色。此外,大多数FPs都有较长的发射范围,可以被较长的波长滤波器检测到(例如GFP也发出黄色的光)。

    • 注意,FPs的某些组合可能会导致一个名为烦恼(荧光[或Förster]共振能量转移)。当一个FP(如CFP)的能量转移激发另一个FP(如YFP)的荧光时,就会发生FRET。只有当两个FPs之间的距离<10nm时,才会发生FRET,在标记相互作用的蛋白时应予以考虑。事实上,FRET经常被用来确定两个蛋白质是否相互作用。

  2. 齐聚反应:第一代FPs易于齐聚。这可能会影响fp融合蛋白的生物学功能。因此,建议使用单体FPs(通常以“m”作为蛋白质名称的首字母,如mCherry)。

  3. 氧气:许多FPs上的发色团(特别是来自GFP的发色团)的成熟需要氧气。因此,这些FPs不能在缺氧环境中使用。最近,从Unagi鳗鱼中分离出的一种新的绿色荧光蛋白被证明可以独立于氧气成熟,适合在厌氧条件下使用。

  4. 成熟时间:成熟时间是指FP正确折叠并产生发色团所需的时间。这可能是几分钟后,翻译成几个小时。例如,超级文件夹GFP (sfGFP)和mNeonGFP在37°C下可以在<10min内折叠,mCherry需要~15min, TagRFP需要~100min, DsRed需要~10h。

  5. 温度:温度会影响FPs的成熟时间和荧光强度。例如,enhanced GFP (EGFP)被优化为37°C,因此最适合哺乳动物或细菌研究,而GFPS65T更适合酵母研究(24-30°C)。

  6. 亮度:亮度是一种测量放射物亮度的方法。亮度的计算方法是用蛋白质的消光系数和量子产率除以1000。在许多情况下,它的亮度与EGFP的亮度相比,被设置为1。有些蛋白质非常暗淡(例如TagRFP657,它的亮度为0.1),这一点应该考虑在内。耐光性可受实验参数(如激发光强度、pH值或温度)的影响。

  7. 耐光性:荧光分子在长时间暴露在激发光下后会褪色(即失去发光能力)。光稳定性可短至100ms (EBFP)或长至1小时(mAmetrine1.2)。然而,对于大多数FPs来说,这是几秒到几分钟。光稳定性受实验参数的影响(如激发光强度、pH值或温度)。

  8. pH稳定性:如果你计划在酸性环境中表达FP(如微酸性的酵母胞浆或突触囊泡),这个参数是很重要的。有些FPs具有不同的ex/em光谱(如mKeima)或随着pH的变化而改变荧光强度(如pHluorin, pHTomato)。

当你计划下一个实验时,把这个清单放在手边,或者把它递给下一个问你“我应该使用哪种荧光蛋白?”如果你正在寻找更多的荧光显微镜工具和技术来帮助你的工作,那就去吧greenfluorescentblog

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盖尔·海莫维奇博士是阿尔伯特·爱因斯坦医学院罗伯特·辛格教授实验室的研究员。他对所有与基因表达相关的东西都感兴趣,尤其是在RNA水平上。他认为的greenfluorescentblog.wordpress.com.

更多有用网站和资源:

关于不同类型FPs的3篇评论文章:

  • Stepanenko等人。(2008)“荧伟德2021足球欧洲杯买球平台光蛋白作为生物标记和生物传感器:在分子和细胞过程中投射色光”咕咕叫。蛋白质。Pept。科学。9(4): 338。

  • Chudakov等。al。(2010)“荧伟德2021足球欧洲杯买球平台光蛋白及其在活细胞和组织成像中的应用”杂志。牧师。90:1103。

  • 吴等。al。(2011)“研究基因表达、核伟德2021足球欧洲杯买球平台定位和动力学的现代荧光蛋白和成像技术”咕咕叫。当今。细胞。医学杂志。23:310。


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