xCas9:利用PAM灵活性设计CRISPR变体

由玛丽传动装置

为了结合DNA,Cas9和其他CRISPR酶需要一个短的PAM序列邻近的目标序列在感兴趣的位置。SpCas9的3 ' NGG PAM经常出现在gc丰富的基因组中,但PAM并不总是出现在你想要修改的位点附近。为了解决PAM问题,研究人员设计了另一种结合不同PAM序列的cas9。现在,胡等人在大卫刘的实验室xCas9是一种识别多种PAMs的酶,如NG、GAA和GAT,但也显示出更高的编辑特异性。我们很高兴能了解更多xCas9- 这就是我们所知道的到目前为止!

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为什么我们需要PAM的灵活性?

IDT估计人类基因组中每42个碱基就有一个NGG PAM。SpCas9定位应该很容易,对吧?是的,没有。如果你只是想制造一个击倒,你可能会很乐意瞄准外显子的任何位置。但如果你想用的话,事情会变得更复杂同源性定向修复做出精确的编辑或敲门。编辑效率急剧下降一旦你的切割部位离插入部位超过10bp,那么如果插入部位附近没有PAM, HDR将会很困难。基本编辑,创建点突变的另一种方法,也有一个严格的编辑窗口,在帕姆的上游约15 nt。即使您的插入位点附近有PAM,也可能由于潜在的偏移网站或低预测的目标效率而受到不希望的相应GRNA。

在Cas9不起作用的情况下,还有其他选项。常用cpf1变体,具有5英尺TTTV PAM,改善富含富有基因座或基因组的靶向。来自其他物种的Cas9,喜欢S.金黄色葡萄球菌N. Meningitidis.需要不同的PAM网站而不是SPCAS9在这种情况下,分别在这种情况下,nngrrt和nnngatt。研究人员还通过诱变PAM交互域,使用像NGAG和NGCG和NGCG和SACAS9等替代PAM一起设计SPCAS9变体。然而,这些替代的PAM序列较长并且通常比ngg更复杂,导致整体基因组频率较低。尽管我们所取得进展,但仍然需要和兴趣具有更短的PAM序列和/或更广泛的PAM灵活性。

通过定向演进创建xCas9

胡等人。利用噬菌体辅助进化生成并选择具有PAM灵活性的Cas9突变体。在本系统中,诱变质粒(MP6.)允许快速,大规模的感兴趣基因的突变。它们创建了一种选择噬菌体(SP),以将融合到细菌聚合酶亚单位ω的催化死SPCAS9(DCAS9)。该构建体设计用于激活编码噬菌体基因III的附件质粒(AP)的转录。辅助性质粒库含有与Protospacer相邻的所有64个可能的NNN PAM序列。如果ω-DCAS9可以识别库PAM,则会诱导基因III的转录,允许噬菌体传播并保持池中的DCAS9序列。根据该逻辑,识别多个PAM的Ω-DCAS9变体应在具有单个PAM识别的蛋白质上具有适应性优势。

XCAS9定向演进示意图

在噬菌体繁殖24天后,Hu等人分离出xCas9 1.0-1.4,再进行72小时的噬菌体辅助进化,生成xCas9 2.0-2.6。这第二轮进化包括噬菌体的持续流出,增加了严格性,并促进了只有最广泛的靶向变异的生存。在最后一轮进化中,他们使用了一个no-G PAM库来丰富具有非ngg PAM活性的Cas9变体,生成了xCas9 3.0-3.13。

测试XCAS9 3.0-3.13,胡等人。首先恢复催化残留物D10和H840。为了确保克隆能够切割,它们在细菌中对NNN PAM库进行测试,其中裂解导致抗斑霉素抗性的损失。XCAS9 3.7显示了最广泛的PAM范围,识别NG,NNG,GAT和CAA PAM,而XCAS9 3.6显示第二个最佳PAM系列。

在哺乳动物细胞中表征XCAS9

胡等人。将XCAS9活动与WT SPCAS9与哺乳动物细胞中的XCAS9活性进行比较,发现XCAS9 3.7显示在NGG PAM上的SPCAS9相同的编辑率。当他们测试各种NG,GAT,GAA和CAA PAM时,他们看到XCAS9 3.7以比SPCAS9更高的效率切割多个PAM:NGT(4.5倍),NGC(2.1倍),NGA(1.6-折叠)和Gaa和Gat(5.2倍)。NGA编辑效率的低增加符合前一个观察,即NGA是SPCAS9的二级PAM。

Hu等人进行了GUIDE-seq分析来表征全基因组脱靶,因为增加PAM的灵活性也可能增加脱靶活性。令人惊讶的是,5种带有NGG PAM序列的gRNAs实际上发生了脱靶效应较低的与SpCas9相比,xCas9为3.6/3.7。对于一些非混杂的grna, xCas9 3.7显示出超过100倍的脱靶编辑减少;对于已知的混杂grna, xCas9 3.7仍然显示出4.2-9.4倍的脱靶编辑比。重要的是,观察到的脱靶位点显示了广泛的PAM序列,表明它们可能比SpCas9脱靶更难以预测。

使用xCas9进行转录调控和碱基编辑

胡等人。还使用XCAS9支架工程转录激活剂。使用NGG PAM,XCAS9 3.7-VPR在激活转录时构建适度优势的SPCAS9-VPR。与NGG PAM相比,含有NG,GAA或GAT PAM的网站平均56-91%转录激活,确认XCAS9 3.7的灵活性。

xCas9的基本编辑器变体也同样灵活。与xCas9 3.7核酸酶类似,融合了第三代胞苷碱基编辑器结构(BE3)的xCas9 3.7与SpCas9-BE3相比,NGG PAM编辑效率略有提高(37比28%)。胞苷碱基在NGT、NGC、GAA和GAT PAMs上的编辑能力有所提高,NGA编辑能力略有提高。腺嘌呤碱基编辑器xCas9 3.7-ABE也遵循同样的模式,与含有spcas9的ABE7.10相比,NGG PAM的编辑性能有所改善(69 vs 48%), NG和GAT PAM的编辑性能也有所改善。

3.7哺乳动物细胞的活性

构造

ngg pam.

NGA PAM.

NGC PAM.

NGT PAM

棉酚PAM

手枪PAM

XCAS9 3.7

41 (1)

32 (1.6)

13 (2.1)

38(4.5)

7.2 (5.2)

-BE3 xCas9 (3.7)

37(1.3)

16 (3.5)

6.2 (13)

24(9.5)

10(> 50)

12(> 100)

安倍xCas9 (3.7)

69(1.4)

43(2)

21日(3)

不检查

16 (> 100)

平均编辑效率(用NGS测量的细胞群中的编辑频率)显示为百分比,与括号中的SPCAS9相比,折叠变化。

xCas9 3.6和3.7的开发表明,我们对Cas9所做的修改只是触及了皮毛。令人惊喜的是,选择一个有益的特性,PAM兼容性,也产生了一种酶,提高了目标编辑率和减少了目标编辑率。这种PAM的灵活性可以将需要非常特定的靶向(如同源定向修复和碱基编辑)的应用扩展到更多的位点。

虽然这些早期的数据很令人兴奋,但我们还有很多我们仍然不知道XCAS9。“我不是100%确定XCAS9比SPCAS9更好。I want everyone to test it because I want to know the answer", says Liu. We’re hoping that these answers come sooner rather than later. Once you’ve tried it, let us know how xCas9 is working for you in the comments section!

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参考文献

胡,Johnny H,等。进化出的Cas9变种具有广泛的PAM兼容性和高DNA特异性。自然(2018)DOI:10.1038 / Nature26155 PubMedPMID:29512652

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